A
Wolbachia
Simbionte
em
Aedes
aegypti
Limites
Infecção
com
Dengue,
Chikungunya,
e
Plasmodium
Luciano A. Moreira, 1,2 Em ~ aki Iturbe-Ormaetxe, 1 Jason A. Jeffery, 3 Guangjin Lu, 3 Alyssa T. Pyke, 4 Lauren M. Hedges, 1
Bruno C. Rocha, 2 Sonja Hall-Mendelin, 5 Andrew Day, 5 Markus Riegler, 1,6 Hugo Leon E., N. 3 Karyn Johnson, 1
Brian H. Kay, 3 Elizabeth A. McGraw, 1 Andrew F. van den Hurk 4,5, Peter A. Ryan, 3 e Scott L. O'Neill1, *
1School of Biological Sciences, The University of Queensland, Brisbane QLD 4072, Austrália
Rachou 2Rene 'Instituto de Pesquisa-FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG, Brasil
3Queensland Institute of Medical Research, Correios Royal Brisbane Hospital, Brisbane QLD 4029, Austrália
4Virology, Queensland Health Legal and Scientific Services, Coopers Plains 4108 QLD, Austrália
5School de Química e Molecular Biosciences, The University of Queensland, Brisbane QLD 4072, Austrália
6Present endereço: Centro de Plantas e Ambiente, Faculdade de Ciências Naturais da Universidade de Western Sydney, Penrith do DC,
NSW 1797, Austrália
* Correspondência: scott.oneill @ uq.edu.au
DOI 10.1016/j.cell.2009.11.042
RESUMO
Wolbachia
são maternalmente herdado intracelular
bactérias simbiontes que são estimados para infectar
mais de 60% de todas as espécies de inseto. Enquanto Wolbachia
é comumente encontrada em muitos mosquitos está ausente
das espécies que são consideradas de grande
importância para a transmissão de patógenos humanos.
A introdução bem sucedida de uma vida-encurtamento
linhagem de Wolbachia
para o vetor da dengue Aedes
aegypti
metades vida adulta, que foi recentemente
relatados. Wolbachia Aqui nós mostramos que este mesmo
infecção também inibe diretamente a capacidade de um intervalo
de agentes patogénicos para infectar esta espécie de mosquito. O
efeito é Wolbachia
estirpe específica e refere-se
Wolbachia
priming do mosquito imune inata
sistema de concorrência e, potencialmente, para limitar
recursos celulares necessárias para a replicação do patógeno.
Nós sugerimos que este patógeno Wolbachia-mediada
interferências podem trabalhar em sinergia com o lifeshortening
estratégia proposta anteriormente para fornecer
uma poderosa abordagem para o controle da transmissão do inseto
doenças.
INTRODUÇÃO
Doenças transmitidas por vetores, como malária, leishmaniose e
dengue, causam um enorme impacto sobre a mortalidade humana e
mundial de morbidade. Com o aumento do movimento humano (Adams
e Kapan, 2009) e os efeitos do aquecimento global (Barclay, 2008;
Pachauri e Reisinger, 2007) re-emergentes patógenos arboviral
(Gould e Salomão, 2008) como a dengue (DENV) e Chikungunya
(CHIKV) Os vírus estão se tornando uma ameaça crescente
(Ng e Ojcius, 2009; Staples et al., 2009).
A dengue é hoje a doença mais importante arbovírus
afligem tropicais e sub-tropicais no mundo inteiro com as comunidades
uma incidência mundial anual estimada de 50 milhões de casos de liderança
a dezenas de milhares de mortes (OMS, 2009). Entre 2004 e
2007, os surtos sem precedentes de CHIKV ocorreram em ilhas de
a oeste do Oceano Índico, no subcontinente indiano e na Europa
(Staples et al., 2009). Aedes aegypti é considerado o principal
vetor de ambos DENV e CHIKV. As vacinas eficazes não
existem para estes vírus, a prevenção de casos humanos se baseia quase
exclusivamente no controle dos vetores do mosquito. Apesar de alguns
utilizando copépodos sucessos recentes como o controle biológico das larvas
(agentes Kay e Vu, 2005), abordagens mais controle estão provando
eficaz nem sustentável, ea dengue está aumentando na sua
distribuição geográfica, frequência de focos e severidade da
doença (Kyle e Harris, 2008).
Uma nova abordagem para o controle da dengue tem sido recentemente
proposta que visa a longevidade do mosquito, em vez de abundância,
através da introdução de um encurtamento da vida de tensão
pipientis da bactéria Wolbachia em populações de A. aegypti
(Brownstein et al. 2003, Cook et al., 2008; Rasgon et al., 2003;
Sinkins e O'Neill, 2000). Wolbachia é uma intracelular herdado
bactéria, prevê-se naturalmente infectar mais de 60% de todos os
mundial de espécies de insetos (Hilgenboecker et al. 2008; Jeyaprakash
e Hoy, 2000) que é capaz de invadir populações de acolhimento
quer através da indução de um número de parasitismo reprodutivo
traços (O'Neill et al., 1997) ou por influenciar positivamente
fitness host (Brownlie et al. 2009; Dobson et al., 2004; Kremer
et al., 2009; Weeks et al., 2007).
Desde o período de incubação extrínseco do vírus e parasitas
dentro do mosquito vetor é muito relativo ao tempo de vida do inseto, Wolbachia
infecções que podem invadir as populações de mosquitos e
reduzir o tempo de vida adulta do A. aegypti são previstos para a redução do patógeno
transmissão sem eliminar a população do mosquito
(Brownstein et al., 2003; Rasgon et al., 2003; Sinkins e O'Neill,
2000). A introdução bem sucedida da vida encurtamento WMEL -
Melanogaster Pop-CLA linhagem de Wolbachia em Drosophila
1268 Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc.
1 6,3 7 0 (25) 0 (25) NA1 6,3 7 0 (25) 0 (25) NAA NA 64 (25) 12 (25)
14 0 (27) 0 (27) NA NA 57 (30) 23 (30)
2 6,0 7 0 (40) 0 (40) 100 (30) 10 (30) 95 (40) 5 (40)
14 0 (40) 0 (40) 97 (30) 37 (30) 95 (40) 20 (40)
3 5,3 7 0 (40) 0 (40) 30 (40) 23 (40) 50 (40) 13 (40)
14 0 (40) 0 (40) 48 (40) 43 (40) 73 (40) 33 (40)
4 7,8 7 5 (40) 3 (40) 78 (40) 63 (40) 63 (40) 45 (40)
14 8 (40) 5 (40) 70 (40) 65 (40) 75 (40) 70 (40)
Mesa
1.
Efeito
de
Wolbachia
ligado
DENV-2
Infecção
PGYP1.out (+ Wolb) PGYP1.out.tet (Wolb) Cairns3 (Wolb)
Entrar DENV-2 dias pós-%% do corpo disseminada% do corpo disseminada%%% do corpo disseminada
Experiência por infecção infecção mL (n), infecção (n), infecção (n), infecção (n), infecção (n), infecção (n)
A. aegypti foram oralmente infectados com DENV-2 frescos e carga viral determinada pela cultura de células de ELISA.
uma linha Este mosquito não estava disponível para o experimento 1
em A. aegypti foi recentemente relatada (McMeniman et al.
2009). Mosquitos realização desta mostra a tensão em torno de Wolbachia
uma redução de 50% na vida adulta do sexo feminino em comparação com não infectados
mosquitos.
Recentes estudos em Drosophila mostraram que a Wolbachia
infecções podem proteger contra vírus RNA (Hedges et al.
2008, Teixeira et al., 2008). As cepas de Wolbachia e wMelCS
wMelPop que D. melanogaster infectar foram encontrados para atraso
mortalidade em moscas quando eles foram infectados com uma variedade de agentes patogênicos
vírus, incluindo Drosophila vírus da hepatite C, vírus e Flock House
Vírus da paralisia Cricket. Hoje é desconhecido como este gerais
efeito anti-viral é tanto em termos de diversidade de Wolbachia
tensões que podem conferir proteção ea variedade de vírus que
são afetadas por ela, embora estudos recentes indicam em Drosophila
que o efeito parece limitado a certas estirpes Wolbachia (Osborne
et al., 2009).
Dado que a tensão wMelPop de Wolbachia fornece proteção
contra vírus RNA em Drosophila, e que o derivado
wMelPop-CLA linhagem de Wolbachia foi introduzida no
mosquito A. aegypti, para encurtar o tempo, podemos supor que
wMelPop CLA-mosquitos infectados podem ter alterado vector
competência para arbovírus. Para testar essa hipótese, foi exposto
Wolbachia-infected and-mosquitos infectados com duas importantes
patógenos humanos; dengue e vírus Chikungunya. Nós
também testaram as estirpes mesmo com o mosquito da malária aviária
parasita Plasmodium falciparum.
RESULTADOS
Wolbachia
e
Dengue
Vírus
Testamos o efeito da Wolbachia na competência do vetor em duas
mosquito origens genéticas: a linha pura original PGYP1,
estavelmente transinfected com wMelPop-CLA (McMeniman et al.
2009) e da mesma estirpe, após cinco gerações de retrocruzamentos
para a progênie F1 de A. aegypti selvagens capturados, recolhidos em Cairns,
Austrália (PGYP1.out). Essas linhagens de mosquitos foram comparados
à tetraciclina tratados com colegas que eram geneticamente idênticos
mas faltava a infecção por Wolbachia, nomeado e PGYP1.tet
PGYP1.out.tet, respectivamente. Além disso, uma cepa selvagem de A.
aegypti estabelecida a partir de material coletado em campo em Cairns,
Austrália (Cairns3) foi usado como um controle negativo adicional.
Os mosquitos foram alimentados com uma refeição de sangue artificial, enriquecida com
DENV-2, em quatro experimentos independentes para examinar possíveis
interações com Wolbachia. A presença do DENV-2, no todo
organismos mosquito foi examinado 7 e 14 dias pós-exposição
cultura de células usando um ensaio imunoenzimático (CCEIA) (Knox et al.
2003). Em três experimentos separados sem Wolbachia-infected
mosquitos (PGYP1.out) testaram positivo para o DENV-2, mas
DENV-2 as taxas de infecção de Wolbachia-mosquitos infectados
(PGYP1.out.tet e Cairns3) variou de 30% -100% (Tabela 1,
Exp 1-3). Corpo taxas de infecção viral em mosquitos PGYP1.out.tet
variou entre 30% -100% após 7 dias e 48% -97%, após
14 dias, enquanto o corpo taxas de infecção viral em Cairns3 variou
de 50% -95% após 7 dias e 57% -95%, após 14 dias. O
divulgadas as taxas de infecção viral medida através da presença
de vírus no mosquito nas pernas tetraciclina tratados com A. aegypti
dias variou entre 10% -23% e 37% -43% após 7 e 14,
respectivamente. Infecções disseminadas no Wolbachia-free
tipo selvagem Cairns3 estirpe de A. aegypti variaram de 5% -13%
e 20% -33% após 7 e 14 dias, respectivamente (Tabela 1) (p <
0,001, qui-quadrado). Em um experimento (Tabela 1, Exp 4) quando
mosquitos foram alimentados com o título mais elevado (107,8 Históricos), do DENV-2
um pequeno número de Wolbachia-mosquitos infectados testou positivo
para o DENV-2, tanto após a infecção 7 and14 dias (5 e 8%,
respectivamente), mas esta foi significativamente inferior a Wolbachia
controles não infectados (63% -78% e 70% -75%, respectivamente)
(p <0,001, qui-quadrado).
Para fornecer um teste mais conservador da Wolbachia-mediated
interferências, os mosquitos foram injetados com intratoracicamente
DENV-2. Estas experiências contornado a barreira do intestino
a infecção (Woodring et al., 1996) e permitiu a entrega
de uma dose de inoculante repetitivo (cerca de 2.750 partículas infecciosas /
mosquito) do DENV-2, que produziu títulos consistente de alta
infecções no controle de mosquitos. Acumulação de genômica
(+ RNA) e anti-genômica (-RNA) RNA foi avaliada em
5 e 14 dias após a injecção por PCR quantitativo em tempo real usando
DENV-2 primers específicos (Richardson et al., 2006). Em tanto tempo
pontos, a quantidade de DENV-2 presentes RNA foi reduzida em
até 4 logs tanto no Wolbachiainfected PGYP1 e PGYP1.out
estirpes de mosquito, em comparação com seus pares tetraciclina
homólogos tratados (Figura 1 e Tabela S1 em linha disponível).
Além disso, quando a saliva do mosquito coletadas de mosquitos
Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc. 1269
Figura
1.
Quantitativos
PCR
Análise
de
Dengue
Vírus
em
Mosquitos
Duas cepas de Wolbachia-guarida (+ Wolb) mosquitos A. aegypti (PGYP1 e PGYP1.out) e os seus homólogos tratados com tetraciclina (-Wolb) (PGYP1.tet e
PGYP1.out.tet) intratoracicamente foram injetados com DENV-2 eo vírus RNA foi estimada pela técnica de PCR em tempo real.
(A) Genomic RNA (+ RNA) no tórax e cabeça 5 dias pós-infecção (dpi), abdômen 5 dpi e mosquito todo 14 dpi.
(B) Anti-RNA genômico (-RNA) no tórax e cabeça 5 dpi, abdômen 5 dpi e mosquito todo 14 dpi.Barras representam ± significa grande
SEM calculado através de quatro
independente replicar experiências. * p <0,05 pelo teste de Mann-Whitney U. Ver também Quadro S1.
Postinjection dia 14 foi testado para a presença de doenças infecciosas
vírus por CCEIA, nenhum dos Wolbachia-mosquitos infectados
amostras testaram positivo para o vírus (dados não mostrados). A dramática
redução na síntese de proteínas virais também foi observado por imunofluorescência
blot microscopia 2A (IFA) (Figuras-2F) e ocidental
análise (figura S1).
Double immunofluorescent coloração das seções da parafina de Wolbachia -
controle de mosquitos infectados 14 dias pós-injeção
DENV-2 apresentou infecção predominantemente na gordura do corpo do mosquito,
omatídeos (Figuras 2A-2F) e sistema nervoso. DENV-2 foi
não detectada em qualquer um desses tecidos em Wolbachia-infected
mosquitos (PGYP1 e PGYP1.out) Considerando que a Wolbachia foi
claramente visíveis no tecido adiposo, omatídeos (Figura 2), cérebro, ovários,
e túbulos de Malpighi. Apenas em alguns indivíduos raros foi DENV2
detectada em pedaços de tecido adiposo em mosquitos PGYP1.out.
No entanto, nestes casos Wolbachia e DENV-2 não foram
co-localizadas nas mesmas celas e DENV-2 foi visto apenas em ocasionais
manchas de células que não estavam infectados com Wolbachia
(Figura 2G). A presença do DENV-2, em alguns PGYP1.out injetado
mosquitos também foi confirmada por Western blot (Figura S1A).
Wolbachia
e
Chikungunya
Vírus
Em seguida, passou a determinar se o fenótipo interferência do vírus
estenderia à CHIKV Alphavirus. A estirpe do vírus utilizado na
os experimentos continha a Ala Val de mutação no
gene da glicoproteína de fusão de membrana E1 (E1-A226V), que tem
sido associada ao aumento da infectividade A. albopictus (Tsetsarkin
et al., 2007). Uma população australiana de A. aegypti foi recentemente
demonstrado também ser um vetor de laboratório altamente eficiente deste vírus
cepa (van den Hurk et al., 2009).
Os mosquitos foram expostos a sangue uma mistura contendo vírus
106,4 CCID50/ml de CHIKV e pós-exposição em vários pontos do tempo,
mosquitos foram processados para quantificar o número de viral
Cópias de RNA utilizando qPCR e CHIKV primers específicos e sondas
(van den Hurk et al., 2009). Imediatamente após a alimentação, o número
de CHIKV genômica (+ cópias de RNA) RNA no corpo e cabeça foram
comparáveis para todas as três linhas, sugerindo que eles embebidas
quantidades semelhantes de vírus (Tabela 2). A mediana do número de cópias
diminuiu em todas as três linhas no dia 2, antes que o aumento no
PGYP1.out.tet e mosquitos Cairns3 ao seu mais alto nível
dia 14-pós-exposição. Dia 14 as taxas de infecção foram 87% e
79% para o PGYP1.out.tet e controles Cairns3 e 17% para
a Wolbachia linha PGYP1.out infectados (p <0,001, qui-quadrado).
Em todos os três grupos de mosquito, CHIKV RNA foi detectado no
pernas e asas imediatamente após a alimentação (Tabela 2). Isto pode
representam tanto o contato direto entre as pernas e / ou asas
eo sangue mistura de vírus ou uma ruptura do mesêntero,
que liberou o vírus diretamente na hemolinfa (Turell, 1988).
Depois de dias 0, CHIKV não foi detectado nas pernas e asas de
qualquer PGYP1.out (+ Wolb) mosquitos. Em contrapartida, em todos os dias
pós-exposição, o vírus foi detectada nas pernas e asas de
PGYP.out.tet e mosquitos controle Cairns3 (-Wolb) e pelo
dia 14, o vírus foi detectada nas pernas e asas de 100%
e 90%, respectivamente, dos mosquitos que tinham corpos positivo
e as cabeças (p = 0,125, qui-quadrado).
Wolbachia
e
Plasmodium
Considerando-se que o efeito da interferência viral aparentemente sólido
para arbovírus dois independentes que, em seguida, testaram o efeito sobre a
protozoário parasita Plasmodium P.. Embora não seja um patógeno humano,
1270 Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc.
esta espécie de parasita da malária é conhecido por ser capaz de infectar A.
mosquitos Aedes aegypti em laboratório. Uma vez que nenhuma espécie de anofelino
mosquitos são conhecidos por exercer infecção natural Wolbachia
e linhas estáveis Wolbachia transinfected ainda têm de ser
geradas, considerou-se o A. aegypti - P. modelo gallinaceum
sistema mais adequado para testar os efeitos de parasitas da malária.
Wolbachia-mosquitos A. aegypti infectados e não infectados
(PGYP1.out e tensões PGYP1.out.tet), bem como uma sensível
cepa de Aedes fluviatilis foram alimentados em paralelo em gallinaceum P. infectados
galinhas. Fluviatilis A. tem uma ampla distribuição geográfica
na América Latina e tem sido usado no laboratório,
Figura
2.
Localização
de
Wolbachia
e
Dengue
Vírus
em
A.
aegypti
Mosquitos
Double imunofluorescência de mosquito
seções mostrando a localização do vírus da dengue (vermelho)
e Wolbachia (verde). Os cortes foram sondados simultaneamente
com anticorpos policlonais anti-wsp (Wolbachia)
e anticorpo monoclonal anti-DENV anticorpo 4G4, seguido por
Alexa 488 (verde) e Alexa 594 (vermelho), conjugada
anticorpos, respectivamente. DNA (azul) é corado com DAPI.
Em painéis (A, B, E, F e G), o vermelho, verde e azul
canais são mesclados. C e D mostram apenas o vermelho eo verde
canais mesclado. (A, C, E) PGYP1.tet (-Wolb) mosquitos,
14 dias pós-injeção de DENV-2 torácica. Dengue
vírus é visível nas células omatídeos (A e C) e tecido gorduroso
(E). (B, D, F) mosquitos PGYP1 (+ Wolb), 14 dias postDENV -
2 injeção torácica. Wolbachia pode ser visto na
omatídeos células e do cérebro (B e D) e tecido adiposo (F). Em
contraste do vírus da dengue não foi detectado. (G) exclusão Celular
de DENV-2 por Wolbachia. A presença de ambos
Wolbachia e DENV-2 foi observada em baixa
freqüência em um pequeno número de Wolbachia-infected outcrossed
mosquitos, 14 dias pós-injeção de DENV-2.
A dengue é apenas aparente falta de Wolbachia em células
contudo. Scale bars: A, D, G: 50 mm; E, F: 20 mm. Ver
também figura S1.
uma malária aviária segura (gallinaceum P.) modelo
vetor, uma vez que não transmitem naturalmente DENV
ou vírus da febre amarela (tason de Camargo e
Krettli, 1981).
Sete dias pós-alimentação em infectados
frangos, intestino médio do mosquito foram dissecados
e presença e número de Plasmodium
oocistos avaliados. O wMelPop-infecção CLA
reduziu significativamente (p <0,0001, qui-quadrado)
a freqüência de mosquitos na população
infectados com pelo menos um único oocisto e assim
potencialmente capaz de transmitir o Plasmodium (Figura
3A) de 74% (controles tet) até 42%.
A presença de Wolbachia também reduziu o
número de oocistos presentes em mosquitos que
foram infectadas com o parasita (Figuras 3A e
3B). Para quantificar a diferença de carga parasitária,
15 dias após a infecção dos mosquitos foram
recolhidos eo DNA foi extraído. O parente
abundância de Plasmodium DNA genômico
foi medido por qPCR da SSU 18S rRNA
gene (Schneider e Shahabuddin, 2000) e
normalizados para o gene Actin mosquito. Os resultados mostraram a
mesmo padrão de interferência, como observado desde a última contagem de oocistos
dados. Em PGYP1.out mosquito Plasmodium DNA genômico
foi de 26 vezes menos abundante do que nas linhas PGYP1.out.tet
(Figura 3C). Imunofluorescência análise utilizando um anti-CSP
(Proteínas de Plasmodium circunsporozoito) anticorpo monoclonal
mostrou a presença de oocistos maduros em ambos os mosquitos
espécies (Figura S2B), mas muito raramente em Wolbachia-infected
mosquitos.
Quando incubado nas seções mosquito com um anti -
Wolbachia (WSP) anticorpo que foi descoberto por acaso
Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc. 1271
Table2.EffectofWolbachiaonCHIKVinfectionPGYP1.out PGYP1.out.tet Cairns3
Dayspost-infecção
% (Infectados)
% (Disseminada)
Mediana Órgãos copiesin /
Chefes (N)
Percentis (25 -75%)
% (Infectados)
% (Disseminada)
Mediana Órgãos copiesin /
Chefes (N)
Percentis (25 e 75%)
% (Infectados)
% (Disseminada)
Mediana Órgãos copiesin /
Chefes (N)
Percentis (25 e 75%)
0 n.s. 100 20 10,2 (10) 10.0-10.4 100 20 10,2 (10) 9.8-10.6 100 10 10,0 (10) ns 9,8-10,5
2 80 0 9,1 (8) n.s. 8.5-9.4 50 30 9,6 (5) 9.3-10.2 70 40 9,5 (7) n.s. 9,2-9,8
4 20 0 7,8 (2) * 7.3-8.2 60 60 10,4 (6) 9.7-10.8 50 30 10,0 (5) ns 9,6-11,7
7 10 0 7,3 (1) n.d. n.d. 100 100 11,1 (10) 10.8-11.3 100 90 10,39 (10) * 8.4-10.8
10 0 0 (0) n.d. n.d. 60 60 10,8 (6) 10.6-10.9 90 90 10,6 (10) n.s. 10,4-11,3
14 17 0 7,7 (3) ** 6.7-8.0 85 100 11,8 (26) 10.9-11.9 80 90 11,3 (23) * 10.3-11.6
A. aegypti foram oralmente infectados com CHIKV fresco e carga viral (log10), determinada por RT-PCR quantitativo em corpos e cabeças ou asas / pernas (para a disseminação viral).Mediana isbased número de cópias apenas nos mosquitos que eram positivos para o vírus. * P <0,05, ** testes p <0,01, *** p <0,001 pelo teste de Mann-Whitney U para as comparações de PGYP1.out e Cairns3 cada contra PGYP1.out.tet.
n.s., não significativo; n.d., não aplicável.
uma infecção de Wolbachia em mosquitos A. fluviatilis, indicando que
esta espécie de mosquito estava naturalmente infectado com Wolbachia.
PCR usando primers geral Wolbachia wsp (Braig et al., 1998;
Zhou et al., 1998) amplificou um fragmento de todos os fluviatilis A.
testado. Seqüência do DNA amplificado indicou que este Wolbachia
tensão (chamado wflu) pertence ao supergrupo B Wolbachia
e é parente distante do wMelPop-CLA. análise qPCR
revelou que a densidade de wflu em A. fluviatilis é de cerca de 20 vezes
menor do que a densidade de wMelPop-CLA em A. aegypti (Figura S3).
Em seguida, examinaram a localização do tecido de Wolbachia em ambos os
espécies de mosquitos e que wMelPop-CLA é distribuído
durante a maior parte dos tecidos do mosquito, incluindo a gordura
corpo, intestino anterior, músculo, tecido nervoso, de Malpighi
túbulos e ovários, wflu está presente apenas nos ovários, Malpighi
túbulos e menos freqüentemente na cabeça, mas ausente omatídeos
(Figuras 4 e S3).
Imunidade
Genes
Para examinar se a resistência dos mosquitos infectados Wolbachia
ao patógeno pode estar relacionado à estimulação ou
priming do sistema imunológico inato do mosquito, é quantificada
a expressão de uma amostra de genes imunes. Foi recentemente
demonstrado que alguns genes diferencialmente imunes são reguladas
de A. aegypti mosquitos infectados com o vírus da dengue (Xi
et al., 2008). Curiosamente, a regulamentação da via imune
desses genes em mosquitos também foi estimulada pela sua natural
microbiota intestinal e criação de mosquitos em condições assépticas, e assim
esgotando sua flora bacteriana, resultou em um aumento de 2 vezes de
vírus da dengue no intestino médio (Xi et al., 2008). Nós escolhemos um subconjunto
dos genes que foram mostrados para ser upregulated sobre dengue
infecção pelo vírus para avaliar o efeito da infecção por Wolbachia em
o sistema imunitário do mosquito.
Os níveis de expressão de genes via onze imune no
wMelPop-CLA PGYP1.out infectados e seu controle não infectados
linha foram comparadas em duas coortes criados de forma independente
mosquitos (Figura 5). Em cada um dos experimentos de quatro genes que codificam
representantes do imune cecropin moléculas efetoras,
defensin, tio-éster que contém proteínas (TEP) e tipo C
lectinas foram significativamente upregulated na presença de
wMelPop-CLA, enquanto FREP18 (fibrinogênio, proteína relacionada
18) os níveis permaneceram inalterados (Figuras 5A e 5B). Em contraste,
enquanto um aumento estatisticamente significativo (p <0,05) diferencial de mRNA
expressão entre os mosquitos com e sem Wolbachia
foi observado para um subconjunto de genes do pedágio, IMD
e Jak / STAT vias de sinalização (Figura 5C Experiment 1Rel
1A e SOCS36E; Figura 5D Experimento 2 - IMD e
Rel 2) estas diferenças não foram consistentes entre os dois experimentos,
sugerindo que a variação entre gerações foi
maior do que as diferenças induzidas pela Wolbachia. Além disso,
Nestes casos, a prega mudança de expressão do mRNA foi baixa
(abaixo de 2 vezes), enquanto que os genes foram induzidos como efetor
até 100 vezes com a presença de Wolbachia (Figura 5A
e 5B). Estes resultados indicam que a presença de wMelPop -
CLA em mosquitos estimula a expressão de pelo menos alguns
genes imunes efetoras, apesar de uma estimulação clara do clássico
imune inata vias de sinalização não foi Repeatably
identificados.
1272 Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc.
DISCUSSÃO
A constatação de que o wMelPop-CLA reduz a infecção por Wolbachia
a capacidade dos dois arbovírus parentesco distante e malária
parasita de estabelecer infecções produtivas no mosquito
mostra que o efeito de interferência patogénico da wMelPop -
CLA tensão é geral e fundamental. O mecanismo é
actualmente incerto, embora nossos dados sugerem que efectoras imunes
genes são upregulated no mosquito na presença do
wMelPop cepa CLA e são susceptíveis de desempenhar um papel, embora
componentes-chave das vias actualmente aceites sinalização
efetores para esses não parecem ser modulados transcriptionally
por Wolbachia.
É também possível que o efeito de interferência observada pode
dizem respeito à concorrência para os componentes de células chave do anfitrião. Isto é suportado
pela observação de que o DENV-2 infecção só foi
Observou Wolbachia em mosquitos infectados em células que faltava
a infecção por Wolbachia (Figura 2G). Sabe-se, por exemplo,
que os insetos precisam obter o colesterol e outros ácidos gordos
de sua dieta (Blitzer et al., 2005) e que a Wolbachia e afins
bactéria também falta a capacidade de biossíntese de sintetizar
colesterol e necessidade de obtê-lo do inseto hospedeiro (Lin e Rikihisa,
2003, Wu et al., 2004). Além dos níveis de colesterol é conhecida a
ser um ácido graxo-chave necessárias para Alphavirus e Flavivirus sucesso
replicação que deve ser obtido a partir da célula hospedeira (Lu
et al., 1999; Mackenzie et al., 2007). Da mesma forma o Plasmodium
também conhecido depender de lipídios anfitrião no estágio de mosquito (Atella
et al., 2009). A importância relativa de efetores imune inata
e mecanismos alternativos, como a concorrência para o acolhimento crítico
componentes celulares, tais como colesterol continua a ser determinado.
Um paradoxo críticos relativos à infecção por Wolbachia e reduções
na competência mosquito vetor é a observação de que
algumas espécies de mosquitos que carregam naturalmente infecções Wolbachia
Figura
3.
Plasmodium
gallinaceum
Detecção
em
Aedes
spp.
Mosquitos
A. aegypti e A. fluviatilis mosquitos foram alimentados com
Gallinaceum P. frangos infectados e parasita foi
detectado.
(A parcelas) Caixa de números mediana e 25 bar (abaixo
mediana) e 75 (acima de mediana) percentis de oocistos
intensidades, 7 dias na postinfection wMelPop-CLA infectados
(PGYP1.out, Wolb +) ou não infectados (PGYP1.out.tet,-Wolb)
A. aegypti e A. fluviatilis em mosquitos (*** p <0,0001 por
Mann-Whitney U). Percentagem de mosquitos que contenha
pelo menos um oocisto é mostrado no gráfico acima.
(B) Mercurochrome coloração de intestino médio do mosquito mostrando
Oocistos gallinaceum P. (setas) em wMelPop (+ Wolb) infectados
e não infectados (-Wolb) e em mosquitos A. fluviatilis,
sete dias pós-infecção (1003
ampliação).
(C) A análise quantitativa de PCR 15 dias após a infecção
mostrando a relativa abundância de Plasmodium 18S SSU
sequências de rRNA em comparação com o gene Actin (** p <
0,005, *** p <0,0001 por Mann-Whitney U). Veja também
Figure S2.
A. albopictus, como são conhecidas por serem vetores competentes para
uma gama de patógenos, incluindo DENV e CHIKV. Nosso fortuito
descoberta de que nosso controle do mosquito A. fluviatillis espécies
suporta cargas de oocistos muito alta, apesar da presença de um natural
ocorrendo deformação Wolbachia, permitiu-nos fornecer uma explicação
para esta observação. Sabe-se que diferentes Wolbachia
cepas comumente mostrar distribuição do tecido bastante variável somática
e densidades (Dobson et al., 1999; Dutton e Sinkins, 2004;
Miller e Riegler, 2006). Nossa análise de A. fluviatilis mostra que
wflu Wolbachia a tensão tem um tropismo tissular muito restrita na
seu mosquito hospedeiro (Figuras 2, 5 e S3) e global Wolbachia
densidades são muito menores (20 vezes), o wMelPop-infecção CLA
de A. aegypti (Figura S3A). Isso provavelmente explica por que não Plasmodium
efeito de interferência é observado nesta espécie e
pode explicar porque A. albopictus é conhecido por ser um competente
vetor de arboviroses ao ser naturalmente infectados com Wolbachia.
A tensão wMelPop Wolbachia em Drosophila é conhecido por ser
incomuns na medida em que cresce a altas densidades (Min e Benzer, 1997)
e tem tropismo tecidual ampla em A. aegypti (Figuras 2 e 5),
que possam sustentar a sua capacidade de interferir de forma tão eficaz
tanto a replicação do vírus e desenvolvimento do parasita.
Nossos resultados têm implicações significativas para qualquer controle futuro
medida com base na utilização dos meios de encurtamento Wolbachia.
Atualmente, o CLA wMelPop-infecção foi demonstrada
para reduzir o tempo de vida médio do mosquito em cerca de 50% em
laboratório (McMeniman et al., 2009) que, embora suficiente para
reduzir significativamente a transmissão poderia ainda permitir que alguns mosquitos
a viver mais tempo do que o período de incubação extrínseca para a maioria dos humanos
patógenos. O efeito de interferência observada relatado aqui
afigura-se suficientemente forte que atuaria em conjunto com
encurtando a vida-efeito para controlar a transmissão de arbovírus.
Life-encurtamento efeitos sobre os mosquitos se tornaria secundária
e apenas agir sobre os indivíduos que possam escapar do viral direta
Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc. 1273
Figura
4.
Wolbachia
Distribuição
em
Aedes
spp.
Mosquitos
Hibridização in situ de fluorescência mostrando a localização de Wolbachia (em vermelho) em diferentes tecidos do A. aegypti e A. fluviatilis em mosquitos. Seções
foram cruzadas com dois Wolbachia específicas 16S rRNA sondas marcadas com rodamina. O DNA é corado com DAPI (azul). Um filtro verde é usada para fornecer contraste.
O diagrama acima foi adaptado a partir de (Jobling, 1987).
(A) parte anterior do aparelho digestivo, mostrando as glândulas salivares (SG) e do cárdia (C), juntamente com o gânglio torácico (G) de A. aegypti infectados
(-Wolb), PGYP1.out (+ Wolb) e mosquitos A. fluviatilis. Painéis B). O tecido gordo mostrando a presença de wMelPop-CLA em PGYP1.out (+ Wolb) mosquitos
mas a ausência da bactéria em PGYP1.out.tet (-Wolb) e em fluviatilis.C A. wMelPop)-CLA está presente no tecido adiposo (FT) em torno do intestino em PGYP1.out
efeito de interferência. A ação combinada de dois Wolba distintos O efeito inibitório do wMelPop-CLA Wolbachia contra
efeitos chia, redução do tempo de vida ea interferência do vírus, deve gallinaceum P. é um passo promissor para a applicaalso possível
reduzir o risco de formação de resistência à estratégia. ção desta estratégia de controle da malária humana. Anopheles
1274 Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc.
Figura
5.
Imune
Gene
Regulamento
em
Resposta
para
Wolbachia
Infecção
RT-qPCR análise da expressão do mRNA de genes selecionados imune PGYP1.out e mosquitos PGYP1.out.tet. Os gráficos mostram o gene-alvo para tarefas domésticas
relação gene para os genes indicada a partir dos caminhos imunológico. Box parcelas de números médio e 25 (barra abaixo mediana) e 75 (acima de mediana)
percentis de 10 mosquitos individuais a partir de uma coorte único. Os resultados de duas coortes de forma independente criados são mostradas (coorte 1 [A e C]; coorte 2 [B e
D]). Medianas estatisticamente significativa pelo teste de Mann Whitney-U (* p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001) são indicados. Prega a mudança para o gene é mostrado acima
parcelas de caixa.
mosquitos, como A. aegypti, não são naturalmente infectado com Wolbachia,
portanto, estes experimentos transinfection em vetor
espécies são cruciais para determinar se Wolbachia também pode
bloco de malária humana em vetores anofelinos. Como a bactéria
é capaz de estabelecer infecção somáticas no vetor da malária humana
Anopheles gambiae (Jin et al., 2009), é provável que o mesmo
efeito de interferência também pode ocorrer quando uma infecção estável
de Wolbachia se torna disponível.
EXPERIMENTAL
PROCEDIMENTOS
Mosquitos
Cinco linhas de A. aegypti foram utilizados diferentes, incluindo o original WMEL pura -
Pop-CLA linha de infectados (PGYP1) eo seu homólogo tetraciclina cured
PGYP1.tet (McMeniman et al., 2009). Uma linha geneticamente diversos derivados
de PGYP1, nomeado PGYP1.out foi gerado por retrocruzamentos PGYP1
por três gerações de machos F1 de 52 campo independente recolhidas isofemale
linhas de Cairns, Austrália. Duas novas gerações de retrocruzamento
foram realizados com o campo F2-material coletado (tipo selvagem de Cairns,
Austrália). O regime de retrocruzamentos usado aqui é esperado para substituir
96,9% do genótipo original puras. A tetraciclina cured contrapartida
(PGYP1.out.tet,-Wolb) foi gerado pelo tratamento antibiótico de retrocruzadas
adultos, seguida de duas gerações de recuperação e re-colonização
com bactérias do intestino, como descrito anteriormente (McMeniman et al., 2009). Um geneticamente
diversificada linha de tipo selvagem, também foi gerado ao mesmo tempo em
campo material coletado proveniente de 245 ovitrampas em sete bairros
de Cairns, na Austrália no final de 2008 e nomeado Cairns3. Para as experiências a malária,
uma cepa suscetível A. fluviatilis (Rodrigues et al. de 2008) foi utilizado em
paralelo com PGYP1.out (+ Wolb) e PGYP1.out.tet (-Wolb) A. aegypti
mosquitos.
Os insetos foram mantidos em um insetário ambiente controlado a 25 º C, 80% RH,
Regime de 12 horas de luz. As larvas foram mantidas com pelotas de comida de peixe (TetraMin,
Tetra) e adultos foram oferecidas solução de sacarose 10%, ad libitum. As fêmeas adultas
Foram Bloodfed em voluntários humanos (UQ aprovação ética humana 2007001379;
QIMR P361 aprovação) para a produção de ovos. Três a cinco dias de idade, do sexo feminino
mosquitos foram utilizados para o DENV e experimentos de infecção por malária. Sete
fêmeas dias de idade foram utilizados para os experimentos CHIKV.
Vírus
Dengue
vírus
Dengue vírus sorotipo 2 (DENV-2) (92T) foi isolado do soro humano
colhido de um paciente de Townsville, na Austrália, em 1992. Stocks de vírus
Chikungunya
Vírus
Exposição
de
Mosquitos
para
Vírus
Injeção
com
2.750
Oral
Alimentação
com
e
Para o
Cell
Cultura
Enzima
Imunoensaios
5 d.
et al., 1998).
Plasmodium
Antes
spp.
Quantitativos
DENV
PCR
Análise
Análise
O
O
Imune
Genes
et al., 2002).
Fluorescência
Em
Hibridização
descrito acima.
COMPLEMENTAR
DADOS
AGRADECIMENTOS
Estamos
Nós
Publicação: 24 de dezembro de 2009
Wolbachia
Simbionte
em
Aedes
aegypti
Limites
Infecção
com
Dengue,
Chikungunya,
e
Plasmodium
Luciano A. Moreira, 1,2 Em ~ aki Iturbe-Ormaetxe, 1 Jason A. Jeffery, 3 Guangjin Lu, 3 Alyssa T. Pyke, 4 Lauren M. Hedges, 1
Bruno C. Rocha, 2 Sonja Hall-Mendelin, 5 Andrew Day, 5 Markus Riegler, 1,6 Hugo Leon E., N. 3 Karyn Johnson, 1
Brian H. Kay, 3 Elizabeth A. McGraw, 1 Andrew F. van den Hurk 4,5, Peter A. Ryan, 3 e Scott L. O'Neill1, *
1School of Biological Sciences, The University of Queensland, Brisbane QLD 4072, Austrália
Rachou 2Rene 'Instituto de Pesquisa-FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG, Brasil
3Queensland Institute of Medical Research, Correios Royal Brisbane Hospital, Brisbane QLD 4029, Austrália
4Virology, Queensland Health Legal and Scientific Services, Coopers Plains 4108 QLD, Austrália
5School de Química e Molecular Biosciences, The University of Queensland, Brisbane QLD 4072, Austrália
6Present endereço: Centro de Plantas e Ambiente, Faculdade de Ciências Naturais da Universidade de Western Sydney, Penrith do DC,
NSW 1797, Austrália
* Correspondência: scott.oneill @ uq.edu.au
DOI 10.1016/j.cell.2009.11.042
RESUMO
Wolbachia
são maternalmente herdado intracelular
bactérias simbiontes que são estimados para infectar
mais de 60% de todas as espécies de inseto. Enquanto Wolbachia
é comumente encontrada em muitos mosquitos está ausente
das espécies que são consideradas de grande
importância para a transmissão de patógenos humanos.
A introdução bem sucedida de uma vida-encurtamento
linhagem de Wolbachia
para o vetor da dengue Aedes
aegypti
metades vida adulta, que foi recentemente
relatados. Wolbachia Aqui nós mostramos que este mesmo
infecção também inibe diretamente a capacidade de um intervalo
de agentes patogénicos para infectar esta espécie de mosquito. O
efeito é Wolbachia
estirpe específica e refere-se
Wolbachia
priming do mosquito imune inata
sistema de concorrência e, potencialmente, para limitar
recursos celulares necessárias para a replicação do patógeno.
Nós sugerimos que este patógeno Wolbachia-mediada
interferências podem trabalhar em sinergia com o lifeshortening
estratégia proposta anteriormente para fornecer
uma poderosa abordagem para o controle da transmissão do inseto
doenças.
INTRODUÇÃO
Doenças transmitidas por vetores, como malária, leishmaniose e
dengue, causam um enorme impacto sobre a mortalidade humana e
mundial de morbidade. Com o aumento do movimento humano (Adams
e Kapan, 2009) e os efeitos do aquecimento global (Barclay, 2008;
Pachauri e Reisinger, 2007) re-emergentes patógenos arboviral
(Gould e Salomão, 2008) como a dengue (DENV) e Chikungunya
(CHIKV) Os vírus estão se tornando uma ameaça crescente
(Ng e Ojcius, 2009; Staples et al., 2009).
A dengue é hoje a doença mais importante arbovírus
afligem tropicais e sub-tropicais no mundo inteiro com as comunidades
uma incidência mundial anual estimada de 50 milhões de casos de liderança
a dezenas de milhares de mortes (OMS, 2009). Entre 2004 e
2007, os surtos sem precedentes de CHIKV ocorreram em ilhas de
a oeste do Oceano Índico, no subcontinente indiano e na Europa
(Staples et al., 2009). Aedes aegypti é considerado o principal
vetor de ambos DENV e CHIKV. As vacinas eficazes não
existem para estes vírus, a prevenção de casos humanos se baseia quase
exclusivamente no controle dos vetores do mosquito. Apesar de alguns
utilizando copépodos sucessos recentes como o controle biológico das larvas
(agentes Kay e Vu, 2005), abordagens mais controle estão provando
eficaz nem sustentável, ea dengue está aumentando na sua
distribuição geográfica, frequência de focos e severidade da
doença (Kyle e Harris, 2008).
Uma nova abordagem para o controle da dengue tem sido recentemente
proposta que visa a longevidade do mosquito, em vez de abundância,
através da introdução de um encurtamento da vida de tensão
pipientis da bactéria Wolbachia em populações de A. aegypti
(Brownstein et al. 2003, Cook et al., 2008; Rasgon et al., 2003;
Sinkins e O'Neill, 2000). Wolbachia é uma intracelular herdado
bactéria, prevê-se naturalmente infectar mais de 60% de todos os
mundial de espécies de insetos (Hilgenboecker et al. 2008; Jeyaprakash
e Hoy, 2000) que é capaz de invadir populações de acolhimento
quer através da indução de um número de parasitismo reprodutivo
traços (O'Neill et al., 1997) ou por influenciar positivamente
fitness host (Brownlie et al. 2009; Dobson et al., 2004; Kremer
et al., 2009; Weeks et al., 2007).
Desde o período de incubação extrínseco do vírus e parasitas
dentro do mosquito vetor é muito relativo ao tempo de vida do inseto, Wolbachia
infecções que podem invadir as populações de mosquitos e
reduzir o tempo de vida adulta do A. aegypti são previstos para a redução do patógeno
transmissão sem eliminar a população do mosquito
(Brownstein et al., 2003; Rasgon et al., 2003; Sinkins e O'Neill,
2000). A introdução bem sucedida da vida encurtamento WMEL -
Melanogaster Pop-CLA linhagem de Wolbachia em Drosophila
1268 Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc.
1 6,3 7 0 (25) 0 (25) NA1 6,3 7 0 (25) 0 (25) NAA NA 64 (25) 12 (25)
14 0 (27) 0 (27) NA NA 57 (30) 23 (30)
2 6,0 7 0 (40) 0 (40) 100 (30) 10 (30) 95 (40) 5 (40)
14 0 (40) 0 (40) 97 (30) 37 (30) 95 (40) 20 (40)
3 5,3 7 0 (40) 0 (40) 30 (40) 23 (40) 50 (40) 13 (40)
14 0 (40) 0 (40) 48 (40) 43 (40) 73 (40) 33 (40)
4 7,8 7 5 (40) 3 (40) 78 (40) 63 (40) 63 (40) 45 (40)
14 8 (40) 5 (40) 70 (40) 65 (40) 75 (40) 70 (40)
Mesa
1.
Efeito
de
Wolbachia
ligado
DENV-2
Infecção
PGYP1.out (+ Wolb) PGYP1.out.tet (Wolb) Cairns3 (Wolb)
Entrar DENV-2 dias pós-%% do corpo disseminada% do corpo disseminada%%% do corpo disseminada
Experiência por infecção infecção mL (n), infecção (n), infecção (n), infecção (n), infecção (n), infecção (n)
A. aegypti foram oralmente infectados com DENV-2 frescos e carga viral determinada pela cultura de células de ELISA.
uma linha Este mosquito não estava disponível para o experimento 1
em A. aegypti foi recentemente relatada (McMeniman et al.
2009). Mosquitos realização desta mostra a tensão em torno de Wolbachia
uma redução de 50% na vida adulta do sexo feminino em comparação com não infectados
mosquitos.
Recentes estudos em Drosophila mostraram que a Wolbachia
infecções podem proteger contra vírus RNA (Hedges et al.
2008, Teixeira et al., 2008). As cepas de Wolbachia e wMelCS
wMelPop que D. melanogaster infectar foram encontrados para atraso
mortalidade em moscas quando eles foram infectados com uma variedade de agentes patogênicos
vírus, incluindo Drosophila vírus da hepatite C, vírus e Flock House
Vírus da paralisia Cricket. Hoje é desconhecido como este gerais
efeito anti-viral é tanto em termos de diversidade de Wolbachia
tensões que podem conferir proteção ea variedade de vírus que
são afetadas por ela, embora estudos recentes indicam em Drosophila
que o efeito parece limitado a certas estirpes Wolbachia (Osborne
et al., 2009).
Dado que a tensão wMelPop de Wolbachia fornece proteção
contra vírus RNA em Drosophila, e que o derivado
wMelPop-CLA linhagem de Wolbachia foi introduzida no
mosquito A. aegypti, para encurtar o tempo, podemos supor que
wMelPop CLA-mosquitos infectados podem ter alterado vector
competência para arbovírus. Para testar essa hipótese, foi exposto
Wolbachia-infected and-mosquitos infectados com duas importantes
patógenos humanos; dengue e vírus Chikungunya. Nós
também testaram as estirpes mesmo com o mosquito da malária aviária
parasita Plasmodium falciparum.
RESULTADOS
Wolbachia
e
Dengue
Vírus
Testamos o efeito da Wolbachia na competência do vetor em duas
mosquito origens genéticas: a linha pura original PGYP1,
estavelmente transinfected com wMelPop-CLA (McMeniman et al.
2009) e da mesma estirpe, após cinco gerações de retrocruzamentos
para a progênie F1 de A. aegypti selvagens capturados, recolhidos em Cairns,
Austrália (PGYP1.out). Essas linhagens de mosquitos foram comparados
à tetraciclina tratados com colegas que eram geneticamente idênticos
mas faltava a infecção por Wolbachia, nomeado e PGYP1.tet
PGYP1.out.tet, respectivamente. Além disso, uma cepa selvagem de A.
aegypti estabelecida a partir de material coletado em campo em Cairns,
Austrália (Cairns3) foi usado como um controle negativo adicional.
Os mosquitos foram alimentados com uma refeição de sangue artificial, enriquecida com
DENV-2, em quatro experimentos independentes para examinar possíveis
interações com Wolbachia. A presença do DENV-2, no todo
organismos mosquito foi examinado 7 e 14 dias pós-exposição
cultura de células usando um ensaio imunoenzimático (CCEIA) (Knox et al.
2003). Em três experimentos separados sem Wolbachia-infected
mosquitos (PGYP1.out) testaram positivo para o DENV-2, mas
DENV-2 as taxas de infecção de Wolbachia-mosquitos infectados
(PGYP1.out.tet e Cairns3) variou de 30% -100% (Tabela 1,
Exp 1-3). Corpo taxas de infecção viral em mosquitos PGYP1.out.tet
variou entre 30% -100% após 7 dias e 48% -97%, após
14 dias, enquanto o corpo taxas de infecção viral em Cairns3 variou
de 50% -95% após 7 dias e 57% -95%, após 14 dias. O
divulgadas as taxas de infecção viral medida através da presença
de vírus no mosquito nas pernas tetraciclina tratados com A. aegypti
dias variou entre 10% -23% e 37% -43% após 7 e 14,
respectivamente. Infecções disseminadas no Wolbachia-free
tipo selvagem Cairns3 estirpe de A. aegypti variaram de 5% -13%
e 20% -33% após 7 e 14 dias, respectivamente (Tabela 1) (p <
0,001, qui-quadrado). Em um experimento (Tabela 1, Exp 4) quando
mosquitos foram alimentados com o título mais elevado (107,8 Históricos), do DENV-2
um pequeno número de Wolbachia-mosquitos infectados testou positivo
para o DENV-2, tanto após a infecção 7 and14 dias (5 e 8%,
respectivamente), mas esta foi significativamente inferior a Wolbachia
controles não infectados (63% -78% e 70% -75%, respectivamente)
(p <0,001, qui-quadrado).
Para fornecer um teste mais conservador da Wolbachia-mediated
interferências, os mosquitos foram injetados com intratoracicamente
DENV-2. Estas experiências contornado a barreira do intestino
a infecção (Woodring et al., 1996) e permitiu a entrega
de uma dose de inoculante repetitivo (cerca de 2.750 partículas infecciosas /
mosquito) do DENV-2, que produziu títulos consistente de alta
infecções no controle de mosquitos. Acumulação de genômica
(+ RNA) e anti-genômica (-RNA) RNA foi avaliada em
5 e 14 dias após a injecção por PCR quantitativo em tempo real usando
DENV-2 primers específicos (Richardson et al., 2006). Em tanto tempo
pontos, a quantidade de DENV-2 presentes RNA foi reduzida em
até 4 logs tanto no Wolbachiainfected PGYP1 e PGYP1.out
estirpes de mosquito, em comparação com seus pares tetraciclina
homólogos tratados (Figura 1 e Tabela S1 em linha disponível).
Além disso, quando a saliva do mosquito coletadas de mosquitos
Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc. 1269
Figura
1.
Quantitativos
PCR
Análise
de
Dengue
Vírus
em
Mosquitos
Duas cepas de Wolbachia-guarida (+ Wolb) mosquitos A. aegypti (PGYP1 e PGYP1.out) e os seus homólogos tratados com tetraciclina (-Wolb) (PGYP1.tet e
PGYP1.out.tet) intratoracicamente foram injetados com DENV-2 eo vírus RNA foi estimada pela técnica de PCR em tempo real.
(A) Genomic RNA (+ RNA) no tórax e cabeça 5 dias pós-infecção (dpi), abdômen 5 dpi e mosquito todo 14 dpi.
(B) Anti-RNA genômico (-RNA) no tórax e cabeça 5 dpi, abdômen 5 dpi e mosquito todo 14 dpi.Barras representam ± significa grande
SEM calculado através de quatro
independente replicar experiências. * p <0,05 pelo teste de Mann-Whitney U. Ver também Quadro S1.
Postinjection dia 14 foi testado para a presença de doenças infecciosas
vírus por CCEIA, nenhum dos Wolbachia-mosquitos infectados
amostras testaram positivo para o vírus (dados não mostrados). A dramática
redução na síntese de proteínas virais também foi observado por imunofluorescência
blot microscopia 2A (IFA) (Figuras-2F) e ocidental
análise (figura S1).
Double immunofluorescent coloração das seções da parafina de Wolbachia -
controle de mosquitos infectados 14 dias pós-injeção
DENV-2 apresentou infecção predominantemente na gordura do corpo do mosquito,
omatídeos (Figuras 2A-2F) e sistema nervoso. DENV-2 foi
não detectada em qualquer um desses tecidos em Wolbachia-infected
mosquitos (PGYP1 e PGYP1.out) Considerando que a Wolbachia foi
claramente visíveis no tecido adiposo, omatídeos (Figura 2), cérebro, ovários,
e túbulos de Malpighi. Apenas em alguns indivíduos raros foi DENV2
detectada em pedaços de tecido adiposo em mosquitos PGYP1.out.
No entanto, nestes casos Wolbachia e DENV-2 não foram
co-localizadas nas mesmas celas e DENV-2 foi visto apenas em ocasionais
manchas de células que não estavam infectados com Wolbachia
(Figura 2G). A presença do DENV-2, em alguns PGYP1.out injetado
mosquitos também foi confirmada por Western blot (Figura S1A).
Wolbachia
e
Chikungunya
Vírus
Em seguida, passou a determinar se o fenótipo interferência do vírus
estenderia à CHIKV Alphavirus. A estirpe do vírus utilizado na
os experimentos continha a Ala Val de mutação no
gene da glicoproteína de fusão de membrana E1 (E1-A226V), que tem
sido associada ao aumento da infectividade A. albopictus (Tsetsarkin
et al., 2007). Uma população australiana de A. aegypti foi recentemente
demonstrado também ser um vetor de laboratório altamente eficiente deste vírus
cepa (van den Hurk et al., 2009).
Os mosquitos foram expostos a sangue uma mistura contendo vírus
106,4 CCID50/ml de CHIKV e pós-exposição em vários pontos do tempo,
mosquitos foram processados para quantificar o número de viral
Cópias de RNA utilizando qPCR e CHIKV primers específicos e sondas
(van den Hurk et al., 2009). Imediatamente após a alimentação, o número
de CHIKV genômica (+ cópias de RNA) RNA no corpo e cabeça foram
comparáveis para todas as três linhas, sugerindo que eles embebidas
quantidades semelhantes de vírus (Tabela 2). A mediana do número de cópias
diminuiu em todas as três linhas no dia 2, antes que o aumento no
PGYP1.out.tet e mosquitos Cairns3 ao seu mais alto nível
dia 14-pós-exposição. Dia 14 as taxas de infecção foram 87% e
79% para o PGYP1.out.tet e controles Cairns3 e 17% para
a Wolbachia linha PGYP1.out infectados (p <0,001, qui-quadrado).
Em todos os três grupos de mosquito, CHIKV RNA foi detectado no
pernas e asas imediatamente após a alimentação (Tabela 2). Isto pode
representam tanto o contato direto entre as pernas e / ou asas
eo sangue mistura de vírus ou uma ruptura do mesêntero,
que liberou o vírus diretamente na hemolinfa (Turell, 1988).
Depois de dias 0, CHIKV não foi detectado nas pernas e asas de
qualquer PGYP1.out (+ Wolb) mosquitos. Em contrapartida, em todos os dias
pós-exposição, o vírus foi detectada nas pernas e asas de
PGYP.out.tet e mosquitos controle Cairns3 (-Wolb) e pelo
dia 14, o vírus foi detectada nas pernas e asas de 100%
e 90%, respectivamente, dos mosquitos que tinham corpos positivo
e as cabeças (p = 0,125, qui-quadrado).
Wolbachia
e
Plasmodium
Considerando-se que o efeito da interferência viral aparentemente sólido
para arbovírus dois independentes que, em seguida, testaram o efeito sobre a
protozoário parasita Plasmodium P.. Embora não seja um patógeno humano,
1270 Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc.
esta espécie de parasita da malária é conhecido por ser capaz de infectar A.
mosquitos Aedes aegypti em laboratório. Uma vez que nenhuma espécie de anofelino
mosquitos são conhecidos por exercer infecção natural Wolbachia
e linhas estáveis Wolbachia transinfected ainda têm de ser
geradas, considerou-se o A. aegypti - P. modelo gallinaceum
sistema mais adequado para testar os efeitos de parasitas da malária.
Wolbachia-mosquitos A. aegypti infectados e não infectados
(PGYP1.out e tensões PGYP1.out.tet), bem como uma sensível
cepa de Aedes fluviatilis foram alimentados em paralelo em gallinaceum P. infectados
galinhas. Fluviatilis A. tem uma ampla distribuição geográfica
na América Latina e tem sido usado no laboratório,
Figura
2.
Localização
de
Wolbachia
e
Dengue
Vírus
em
A.
aegypti
Mosquitos
Double imunofluorescência de mosquito
seções mostrando a localização do vírus da dengue (vermelho)
e Wolbachia (verde). Os cortes foram sondados simultaneamente
com anticorpos policlonais anti-wsp (Wolbachia)
e anticorpo monoclonal anti-DENV anticorpo 4G4, seguido por
Alexa 488 (verde) e Alexa 594 (vermelho), conjugada
anticorpos, respectivamente. DNA (azul) é corado com DAPI.
Em painéis (A, B, E, F e G), o vermelho, verde e azul
canais são mesclados. C e D mostram apenas o vermelho eo verde
canais mesclado. (A, C, E) PGYP1.tet (-Wolb) mosquitos,
14 dias pós-injeção de DENV-2 torácica. Dengue
vírus é visível nas células omatídeos (A e C) e tecido gorduroso
(E). (B, D, F) mosquitos PGYP1 (+ Wolb), 14 dias postDENV -
2 injeção torácica. Wolbachia pode ser visto na
omatídeos células e do cérebro (B e D) e tecido adiposo (F). Em
contraste do vírus da dengue não foi detectado. (G) exclusão Celular
de DENV-2 por Wolbachia. A presença de ambos
Wolbachia e DENV-2 foi observada em baixa
freqüência em um pequeno número de Wolbachia-infected outcrossed
mosquitos, 14 dias pós-injeção de DENV-2.
A dengue é apenas aparente falta de Wolbachia em células
contudo. Scale bars: A, D, G: 50 mm; E, F: 20 mm. Ver
também figura S1.
uma malária aviária segura (gallinaceum P.) modelo
vetor, uma vez que não transmitem naturalmente DENV
ou vírus da febre amarela (tason de Camargo e
Krettli, 1981).
Sete dias pós-alimentação em infectados
frangos, intestino médio do mosquito foram dissecados
e presença e número de Plasmodium
oocistos avaliados. O wMelPop-infecção CLA
reduziu significativamente (p <0,0001, qui-quadrado)
a freqüência de mosquitos na população
infectados com pelo menos um único oocisto e assim
potencialmente capaz de transmitir o Plasmodium (Figura
3A) de 74% (controles tet) até 42%.
A presença de Wolbachia também reduziu o
número de oocistos presentes em mosquitos que
foram infectadas com o parasita (Figuras 3A e
3B). Para quantificar a diferença de carga parasitária,
15 dias após a infecção dos mosquitos foram
recolhidos eo DNA foi extraído. O parente
abundância de Plasmodium DNA genômico
foi medido por qPCR da SSU 18S rRNA
gene (Schneider e Shahabuddin, 2000) e
normalizados para o gene Actin mosquito. Os resultados mostraram a
mesmo padrão de interferência, como observado desde a última contagem de oocistos
dados. Em PGYP1.out mosquito Plasmodium DNA genômico
foi de 26 vezes menos abundante do que nas linhas PGYP1.out.tet
(Figura 3C). Imunofluorescência análise utilizando um anti-CSP
(Proteínas de Plasmodium circunsporozoito) anticorpo monoclonal
mostrou a presença de oocistos maduros em ambos os mosquitos
espécies (Figura S2B), mas muito raramente em Wolbachia-infected
mosquitos.
Quando incubado nas seções mosquito com um anti -
Wolbachia (WSP) anticorpo que foi descoberto por acaso
Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc. 1271
Table2.EffectofWolbachiaonCHIKVinfectionPGYP1.out PGYP1.out.tet Cairns3
Dayspost-infecção
% (Infectados)
% (Disseminada)
Mediana Órgãos copiesin /
Chefes (N)
Percentis (25 -75%)
% (Infectados)
% (Disseminada)
Mediana Órgãos copiesin /
Chefes (N)
Percentis (25 e 75%)
% (Infectados)
% (Disseminada)
Mediana Órgãos copiesin /
Chefes (N)
Percentis (25 e 75%)
0 n.s. 100 20 10,2 (10) 10.0-10.4 100 20 10,2 (10) 9.8-10.6 100 10 10,0 (10) ns 9,8-10,5
2 80 0 9,1 (8) n.s. 8.5-9.4 50 30 9,6 (5) 9.3-10.2 70 40 9,5 (7) n.s. 9,2-9,8
4 20 0 7,8 (2) * 7.3-8.2 60 60 10,4 (6) 9.7-10.8 50 30 10,0 (5) ns 9,6-11,7
7 10 0 7,3 (1) n.d. n.d. 100 100 11,1 (10) 10.8-11.3 100 90 10,39 (10) * 8.4-10.8
10 0 0 (0) n.d. n.d. 60 60 10,8 (6) 10.6-10.9 90 90 10,6 (10) n.s. 10,4-11,3
14 17 0 7,7 (3) ** 6.7-8.0 85 100 11,8 (26) 10.9-11.9 80 90 11,3 (23) * 10.3-11.6
A. aegypti foram oralmente infectados com CHIKV fresco e carga viral (log10), determinada por RT-PCR quantitativo em corpos e cabeças ou asas / pernas (para a disseminação viral).Mediana isbased número de cópias apenas nos mosquitos que eram positivos para o vírus. * P <0,05, ** testes p <0,01, *** p <0,001 pelo teste de Mann-Whitney U para as comparações de PGYP1.out e Cairns3 cada contra PGYP1.out.tet.
n.s., não significativo; n.d., não aplicável.
uma infecção de Wolbachia em mosquitos A. fluviatilis, indicando que
esta espécie de mosquito estava naturalmente infectado com Wolbachia.
PCR usando primers geral Wolbachia wsp (Braig et al., 1998;
Zhou et al., 1998) amplificou um fragmento de todos os fluviatilis A.
testado. Seqüência do DNA amplificado indicou que este Wolbachia
tensão (chamado wflu) pertence ao supergrupo B Wolbachia
e é parente distante do wMelPop-CLA. análise qPCR
revelou que a densidade de wflu em A. fluviatilis é de cerca de 20 vezes
menor do que a densidade de wMelPop-CLA em A. aegypti (Figura S3).
Em seguida, examinaram a localização do tecido de Wolbachia em ambos os
espécies de mosquitos e que wMelPop-CLA é distribuído
durante a maior parte dos tecidos do mosquito, incluindo a gordura
corpo, intestino anterior, músculo, tecido nervoso, de Malpighi
túbulos e ovários, wflu está presente apenas nos ovários, Malpighi
túbulos e menos freqüentemente na cabeça, mas ausente omatídeos
(Figuras 4 e S3).
Imunidade
Genes
Para examinar se a resistência dos mosquitos infectados Wolbachia
ao patógeno pode estar relacionado à estimulação ou
priming do sistema imunológico inato do mosquito, é quantificada
a expressão de uma amostra de genes imunes. Foi recentemente
demonstrado que alguns genes diferencialmente imunes são reguladas
de A. aegypti mosquitos infectados com o vírus da dengue (Xi
et al., 2008). Curiosamente, a regulamentação da via imune
desses genes em mosquitos também foi estimulada pela sua natural
microbiota intestinal e criação de mosquitos em condições assépticas, e assim
esgotando sua flora bacteriana, resultou em um aumento de 2 vezes de
vírus da dengue no intestino médio (Xi et al., 2008). Nós escolhemos um subconjunto
dos genes que foram mostrados para ser upregulated sobre dengue
infecção pelo vírus para avaliar o efeito da infecção por Wolbachia em
o sistema imunitário do mosquito.
Os níveis de expressão de genes via onze imune no
wMelPop-CLA PGYP1.out infectados e seu controle não infectados
linha foram comparadas em duas coortes criados de forma independente
mosquitos (Figura 5). Em cada um dos experimentos de quatro genes que codificam
representantes do imune cecropin moléculas efetoras,
defensin, tio-éster que contém proteínas (TEP) e tipo C
lectinas foram significativamente upregulated na presença de
wMelPop-CLA, enquanto FREP18 (fibrinogênio, proteína relacionada
18) os níveis permaneceram inalterados (Figuras 5A e 5B). Em contraste,
enquanto um aumento estatisticamente significativo (p <0,05) diferencial de mRNA
expressão entre os mosquitos com e sem Wolbachia
foi observado para um subconjunto de genes do pedágio, IMD
e Jak / STAT vias de sinalização (Figura 5C Experiment 1Rel
1A e SOCS36E; Figura 5D Experimento 2 - IMD e
Rel 2) estas diferenças não foram consistentes entre os dois experimentos,
sugerindo que a variação entre gerações foi
maior do que as diferenças induzidas pela Wolbachia. Além disso,
Nestes casos, a prega mudança de expressão do mRNA foi baixa
(abaixo de 2 vezes), enquanto que os genes foram induzidos como efetor
até 100 vezes com a presença de Wolbachia (Figura 5A
e 5B). Estes resultados indicam que a presença de wMelPop -
CLA em mosquitos estimula a expressão de pelo menos alguns
genes imunes efetoras, apesar de uma estimulação clara do clássico
imune inata vias de sinalização não foi Repeatably
identificados.
1272 Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc.
DISCUSSÃO
A constatação de que o wMelPop-CLA reduz a infecção por Wolbachia
a capacidade dos dois arbovírus parentesco distante e malária
parasita de estabelecer infecções produtivas no mosquito
mostra que o efeito de interferência patogénico da wMelPop -
CLA tensão é geral e fundamental. O mecanismo é
actualmente incerto, embora nossos dados sugerem que efectoras imunes
genes são upregulated no mosquito na presença do
wMelPop cepa CLA e são susceptíveis de desempenhar um papel, embora
componentes-chave das vias actualmente aceites sinalização
efetores para esses não parecem ser modulados transcriptionally
por Wolbachia.
É também possível que o efeito de interferência observada pode
dizem respeito à concorrência para os componentes de células chave do anfitrião. Isto é suportado
pela observação de que o DENV-2 infecção só foi
Observou Wolbachia em mosquitos infectados em células que faltava
a infecção por Wolbachia (Figura 2G). Sabe-se, por exemplo,
que os insetos precisam obter o colesterol e outros ácidos gordos
de sua dieta (Blitzer et al., 2005) e que a Wolbachia e afins
bactéria também falta a capacidade de biossíntese de sintetizar
colesterol e necessidade de obtê-lo do inseto hospedeiro (Lin e Rikihisa,
2003, Wu et al., 2004). Além dos níveis de colesterol é conhecida a
ser um ácido graxo-chave necessárias para Alphavirus e Flavivirus sucesso
replicação que deve ser obtido a partir da célula hospedeira (Lu
et al., 1999; Mackenzie et al., 2007). Da mesma forma o Plasmodium
também conhecido depender de lipídios anfitrião no estágio de mosquito (Atella
et al., 2009). A importância relativa de efetores imune inata
e mecanismos alternativos, como a concorrência para o acolhimento crítico
componentes celulares, tais como colesterol continua a ser determinado.
Um paradoxo críticos relativos à infecção por Wolbachia e reduções
na competência mosquito vetor é a observação de que
algumas espécies de mosquitos que carregam naturalmente infecções Wolbachia
Figura
3.
Plasmodium
gallinaceum
Detecção
em
Aedes
spp.
Mosquitos
A. aegypti e A. fluviatilis mosquitos foram alimentados com
Gallinaceum P. frangos infectados e parasita foi
detectado.
(A parcelas) Caixa de números mediana e 25 bar (abaixo
mediana) e 75 (acima de mediana) percentis de oocistos
intensidades, 7 dias na postinfection wMelPop-CLA infectados
(PGYP1.out, Wolb +) ou não infectados (PGYP1.out.tet,-Wolb)
A. aegypti e A. fluviatilis em mosquitos (*** p <0,0001 por
Mann-Whitney U). Percentagem de mosquitos que contenha
pelo menos um oocisto é mostrado no gráfico acima.
(B) Mercurochrome coloração de intestino médio do mosquito mostrando
Oocistos gallinaceum P. (setas) em wMelPop (+ Wolb) infectados
e não infectados (-Wolb) e em mosquitos A. fluviatilis,
sete dias pós-infecção (1003
ampliação).
(C) A análise quantitativa de PCR 15 dias após a infecção
mostrando a relativa abundância de Plasmodium 18S SSU
sequências de rRNA em comparação com o gene Actin (** p <
0,005, *** p <0,0001 por Mann-Whitney U). Veja também
Figure S2.
A. albopictus, como são conhecidas por serem vetores competentes para
uma gama de patógenos, incluindo DENV e CHIKV. Nosso fortuito
descoberta de que nosso controle do mosquito A. fluviatillis espécies
suporta cargas de oocistos muito alta, apesar da presença de um natural
ocorrendo deformação Wolbachia, permitiu-nos fornecer uma explicação
para esta observação. Sabe-se que diferentes Wolbachia
cepas comumente mostrar distribuição do tecido bastante variável somática
e densidades (Dobson et al., 1999; Dutton e Sinkins, 2004;
Miller e Riegler, 2006). Nossa análise de A. fluviatilis mostra que
wflu Wolbachia a tensão tem um tropismo tissular muito restrita na
seu mosquito hospedeiro (Figuras 2, 5 e S3) e global Wolbachia
densidades são muito menores (20 vezes), o wMelPop-infecção CLA
de A. aegypti (Figura S3A). Isso provavelmente explica por que não Plasmodium
efeito de interferência é observado nesta espécie e
pode explicar porque A. albopictus é conhecido por ser um competente
vetor de arboviroses ao ser naturalmente infectados com Wolbachia.
A tensão wMelPop Wolbachia em Drosophila é conhecido por ser
incomuns na medida em que cresce a altas densidades (Min e Benzer, 1997)
e tem tropismo tecidual ampla em A. aegypti (Figuras 2 e 5),
que possam sustentar a sua capacidade de interferir de forma tão eficaz
tanto a replicação do vírus e desenvolvimento do parasita.
Nossos resultados têm implicações significativas para qualquer controle futuro
medida com base na utilização dos meios de encurtamento Wolbachia.
Atualmente, o CLA wMelPop-infecção foi demonstrada
para reduzir o tempo de vida médio do mosquito em cerca de 50% em
laboratório (McMeniman et al., 2009) que, embora suficiente para
reduzir significativamente a transmissão poderia ainda permitir que alguns mosquitos
a viver mais tempo do que o período de incubação extrínseca para a maioria dos humanos
patógenos. O efeito de interferência observada relatado aqui
afigura-se suficientemente forte que atuaria em conjunto com
encurtando a vida-efeito para controlar a transmissão de arbovírus.
Life-encurtamento efeitos sobre os mosquitos se tornaria secundária
e apenas agir sobre os indivíduos que possam escapar do viral direta
Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc. 1273
Figura
4.
Wolbachia
Distribuição
em
Aedes
spp.
Mosquitos
Hibridização in situ de fluorescência mostrando a localização de Wolbachia (em vermelho) em diferentes tecidos do A. aegypti e A. fluviatilis em mosquitos. Seções
foram cruzadas com dois Wolbachia específicas 16S rRNA sondas marcadas com rodamina. O DNA é corado com DAPI (azul). Um filtro verde é usada para fornecer contraste.
O diagrama acima foi adaptado a partir de (Jobling, 1987).
(A) parte anterior do aparelho digestivo, mostrando as glândulas salivares (SG) e do cárdia (C), juntamente com o gânglio torácico (G) de A. aegypti infectados
(-Wolb), PGYP1.out (+ Wolb) e mosquitos A. fluviatilis. Painéis B). O tecido gordo mostrando a presença de wMelPop-CLA em PGYP1.out (+ Wolb) mosquitos
mas a ausência da bactéria em PGYP1.out.tet (-Wolb) e em fluviatilis.C A. wMelPop)-CLA está presente no tecido adiposo (FT) em torno do intestino em PGYP1.out
efeito de interferência. A ação combinada de dois Wolba distintos O efeito inibitório do wMelPop-CLA Wolbachia contra
efeitos chia, redução do tempo de vida ea interferência do vírus, deve gallinaceum P. é um passo promissor para a applicaalso possível
reduzir o risco de formação de resistência à estratégia. ção desta estratégia de controle da malária humana. Anopheles
1274 Cell 139, 1268-1278, 24 de dezembro de 2009 ª 2009 Elsevier Inc.
Figura
5.
Imune
Gene
Regulamento
em
Resposta
para
Wolbachia
Infecção
RT-qPCR análise da expressão do mRNA de genes selecionados imune PGYP1.out e mosquitos PGYP1.out.tet. Os gráficos mostram o gene-alvo para tarefas domésticas
relação gene para os genes indicada a partir dos caminhos imunológico. Box parcelas de números médio e 25 (barra abaixo mediana) e 75 (acima de mediana)
percentis de 10 mosquitos individuais a partir de uma coorte único. Os resultados de duas coortes de forma independente criados são mostradas (coorte 1 [A e C]; coorte 2 [B e
D]). Medianas estatisticamente significativa pelo teste de Mann Whitney-U (* p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001) são indicados. Prega a mudança para o gene é mostrado acima
parcelas de caixa.
mosquitos, como A. aegypti, não são naturalmente infectado com Wolbachia,
portanto, estes experimentos transinfection em vetor
espécies são cruciais para determinar se Wolbachia também pode
bloco de malária humana em vetores anofelinos. Como a bactéria
é capaz de estabelecer infecção somáticas no vetor da malária humana
Anopheles gambiae (Jin et al., 2009), é provável que o mesmo
efeito de interferência também pode ocorrer quando uma infecção estável
de Wolbachia se torna disponível.
EXPERIMENTAL
PROCEDIMENTOS
Mosquitos
Cinco linhas de A. aegypti foram utilizados diferentes, incluindo o original WMEL pura -
Pop-CLA linha de infectados (PGYP1) eo seu homólogo tetraciclina cured
PGYP1.tet (McMeniman et al., 2009). Uma linha geneticamente diversos derivados
de PGYP1, nomeado PGYP1.out foi gerado por retrocruzamentos PGYP1
por três gerações de machos F1 de 52 campo independente recolhidas isofemale
linhas de Cairns, Austrália. Duas novas gerações de retrocruzamento
foram realizados com o campo F2-material coletado (tipo selvagem de Cairns,
Austrália). O regime de retrocruzamentos usado aqui é esperado para substituir
96,9% do genótipo original puras. A tetraciclina cured contrapartida
(PGYP1.out.tet,-Wolb) foi gerado pelo tratamento antibiótico de retrocruzadas
adultos, seguida de duas gerações de recuperação e re-colonização
com bactérias do intestino, como descrito anteriormente (McMeniman et al., 2009). Um geneticamente
diversificada linha de tipo selvagem, também foi gerado ao mesmo tempo em
campo material coletado proveniente de 245 ovitrampas em sete bairros
de Cairns, na Austrália no final de 2008 e nomeado Cairns3. Para as experiências a malária,
uma cepa suscetível A. fluviatilis (Rodrigues et al. de 2008) foi utilizado em
paralelo com PGYP1.out (+ Wolb) e PGYP1.out.tet (-Wolb) A. aegypti
mosquitos.
Os insetos foram mantidos em um insetário ambiente controlado a 25 º C, 80% RH,
Regime de 12 horas de luz. As larvas foram mantidas com pelotas de comida de peixe (TetraMin,
Tetra) e adultos foram oferecidas solução de sacarose 10%, ad libitum. As fêmeas adultas
Foram Bloodfed em voluntários humanos (UQ aprovação ética humana 2007001379;
QIMR P361 aprovação) para a produção de ovos. Três a cinco dias de idade, do sexo feminino
mosquitos foram utilizados para o DENV e experimentos de infecção por malária. Sete
fêmeas dias de idade foram utilizados para os experimentos CHIKV.
Vírus
Dengue
vírus
Dengue vírus sorotipo 2 (DENV-2) (92T) foi isolado do soro humano
colhido de um paciente de Townsville, na Austrália, em 1992. Stocks de vírus
Chikungunya
Vírus
Exposição
de
Mosquitos
para
Vírus
Injeção
com
2.750
Oral
Alimentação
com
e
Para o
Cell
Cultura
Enzima
Imunoensaios
5 d.
et al., 1998).
Plasmodium
Antes
spp.
Quantitativos
DENV
PCR
Análise
Análise
O
O
Imune
Genes
et al., 2002).
Fluorescência
Em
Hibridização
descrito acima.
COMPLEMENTAR
DADOS
AGRADECIMENTOS
Estamos
Nós
Publicação: 24 de dezembro de 2009
A
Wolbachia
Symbiont
in
Aedes
aegypti
Limits
Infection
with
Dengue,
Chikungunya,
and
Plasmodium
Luciano A. Moreira,1,2 In˜ aki Iturbe-Ormaetxe,1 Jason A. Jeffery,3 Guangjin Lu,3 Alyssa T. Pyke,4 Lauren M. Hedges,1
Bruno C. Rocha,2 Sonja Hall-Mendelin,5 Andrew Day,5 Markus Riegler,1,6 Leon E. Hugo,3 Karyn N. Johnson,1
Brian H. Kay,3 Elizabeth A. McGraw,1 Andrew F. van den Hurk,4,5 Peter A. Ryan,3 and Scott L. O’Neill1,*
1School of Biological Sciences, The University of Queensland, Brisbane QLD 4072, Australia
2Rene´ Rachou Research Institute-FIOCRUZ, Belo Horizonte MG, Brazil
3Queensland Institute of Medical Research, Post Office Royal Brisbane Hospital, Brisbane QLD 4029, Australia
4Virology, Queensland Health Forensic and Scientific Services, Coopers Plains QLD 4108, Australia
5School of Chemical and Molecular Biosciences, The University of Queensland, Brisbane QLD 4072, Australia
6Present address: Centre for Plants and the Environment, School of Natural Sciences, University of Western Sydney, Penrith South DC,
NSW 1797, Australia
*Correspondence: scott.oneill@uq.edu.au
DOI 10.1016/j.cell.2009.11.042
SUMMARY
Wolbachia
are maternally inherited intracellular
bacterial symbionts that are estimated to infect
more than 60% of all insect species. While Wolbachia
is commonly found in many mosquitoes it is absent
from the species that are considered to be of major
importance for the transmission of human pathogens.
The successful introduction of a life-shortening
strain of Wolbachia
into the dengue vector Aedes
aegypti
that halves adult lifespan has recently been
reported. Here we show that this same Wolbachia
infection also directly inhibits the ability of a range
of pathogens to infect this mosquito species. The
effect is Wolbachia
strain specific and relates to
Wolbachia
priming of the mosquito innate immune
system and potentially competition for limiting
cellular resources required for pathogen replication.
We suggest that this Wolbachia-mediated pathogen
interference may work synergistically with the lifeshortening
strategy proposed previously to provide
a powerful approach for the control of insect transmitted
diseases.
INTRODUCTION
Vector-borne diseases such as malaria, leishmaniasis and
dengue, cause a tremendous impact on human mortality and
morbidity worldwide. With increasing human movement (Adams
and Kapan, 2009) and global warming effects (Barclay, 2008;
Pachauri and Reisinger, 2007) re-emerging arboviral pathogens
(Gould and Solomon, 2008) such as dengue (DENV) and Chikungunya
(CHIKV) viruses are becoming an increasing threat
(Ng and Ojcius, 2009; Staples et al., 2009).
Dengue is currently the most significant arboviral disease
afflicting tropical and sub-tropical communities worldwide with
an estimated global annual incidence of 50 million cases leading
to tens of thousands of deaths (WHO, 2009). Between 2004 and
2007, unprecedented outbreaks of CHIKV occurred in islands of
the western Indian Ocean, the Indian subcontinent and Europe
(Staples et al., 2009). Aedes aegypti is considered the primary
vector of both DENV and CHIKV. As effective vaccines do not
exist for these viruses, prevention of human cases relies almost
exclusively on control of the mosquito vectors. Despite some
recent successes utilizing copepods as larval biological control
agents (Kay and Vu, 2005), most control approaches are proving
neither effective nor sustainable, and dengue is increasing in its
geographic distribution, frequency of outbreaks and severity of
disease (Kyle and Harris, 2008).
A new approach to dengue control has recently been
proposed that targets mosquito longevity rather than abundance,
through the introduction of a life-shortening strain of
the bacterium Wolbachia pipientis into A. aegypti populations
(Brownstein et al., 2003; Cook et al., 2008; Rasgon et al., 2003;
Sinkins and O’Neill, 2000). Wolbachia is an intracellular inherited
bacterium, predicted to naturally infect more than 60% of all
insect species worldwide (Hilgenboecker et al., 2008; Jeyaprakash
and Hoy, 2000) that is able to invade host populations
through either the induction of a number of reproductive parasitism
traits (O’Neill et al., 1997) or by positively influencing
host fitness (Brownlie et al., 2009; Dobson et al., 2004; Kremer
et al., 2009; Weeks et al., 2007).
Since the extrinsic incubation period of viruses and parasites
within the mosquito vector is long relative to insect lifespan, Wolbachia
infections that can invade mosquito populations and
reduce adult A. aegypti lifespan are predicted to reduce pathogen
transmission without eliminating the mosquito population
(Brownstein et al., 2003; Rasgon et al., 2003; Sinkins and O’Neill,
2000). The successful introduction of the life-shortening wMel-
Pop-CLA strain of Wolbachia from Drosophila melanogaster
1268 Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc.
1 6.3 7 0 (25) 0 (25) NA1 6.3 7 0 (25) 0 (25) NAa NA 64 (25) 12 (25)
14 0 (27) 0 (27) NA NA 57 (30) 23 (30)
2 6.0 7 0 (40) 0 (40) 100 (30) 10 (30) 95 (40) 5 (40)
14 0 (40) 0 (40) 97 (30) 37 (30) 95 (40) 20 (40)
3 5.3 7 0 (40) 0 (40) 30 (40) 23 (40) 50 (40) 13 (40)
14 0 (40) 0 (40) 48 (40) 43 (40) 73 (40) 33 (40)
4 7.8 7 5 (40) 3 (40) 78 (40) 63 (40) 63 (40) 45 (40)
14 8 (40) 5 (40) 70 (40) 65 (40) 75 (40) 70 (40)
Table
1.
Effect
of
Wolbachia
on
DENV-2
Infection
PGYP1.out (+ Wolb) PGYP1.out.tet ([1] Wolb) Cairns3 ([1] Wolb)
Log DENV-2 Days post-% body % disseminated % body % disseminated % body % disseminated
Experiment per mL infection infection (n) infection (n) infection (n) infection (n) infection (n) infection (n)
A. aegypti were orally infected with fresh DENV-2 and viral load determined by cell culture ELISA.
a This mosquito line was unavailable for experiment 1
into A. aegypti has recently been reported (McMeniman et al.,
2009). Mosquitoes carrying this Wolbachia strain show around
a 50% reduction in adult female lifespan compared to uninfected
mosquitoes.
Recent studies in Drosophila have shown that Wolbachia
infections can protect against RNA viruses (Hedges et al.,
2008; Teixeira et al., 2008). The Wolbachia strains wMelCS and
wMelPop that infect D. melanogaster were found to delay
mortality in flies when they were infected with a range of pathogenic
viruses including Drosophila C virus, Flock House virus and
Cricket paralysis virus. It is currently unknown how general this
anti-viral effect is in terms of both the diversity of Wolbachia
strains that can confer protection and the range of viruses that
are affected by it although recent studies in Drosophila indicate
that the effect appears limited to certain Wolbachia strains (Osborne
et al., 2009).
Given that the wMelPop strain of Wolbachia provides protection
against RNA viruses in Drosophila, and that the derived
wMelPop-CLA strain of Wolbachia was introduced into the
mosquito A. aegypti to shorten lifespan, we hypothesized that
wMelPop-CLA infected mosquitoes may have altered vector
competence for arboviruses. To test this hypothesis we exposed
Wolbachia-infected and -uninfected mosquitoes to two important
human pathogens; dengue and Chikungunya viruses. We
also tested the same mosquito strains with the avian malaria
parasite, Plasmodium gallinaceum.
RESULTS
Wolbachia
and
Dengue
Virus
We tested the effect of Wolbachia on vector competence in two
mosquito genetic backgrounds: the original inbred PGYP1 line,
stably transinfected with wMelPop-CLA (McMeniman et al.,
2009) and the same strain after five generations of backcrossing
to the F1 progeny of wild-caught A. aegypti, collected in Cairns,
Australia (PGYP1.out). These mosquito strains were compared
to tetracycline-treated counterparts that were genetically identical
but lacked the Wolbachia infection, named PGYP1.tet and
PGYP1.out.tet, respectively. In addition, a wild-type strain of A.
aegypti established from field-collected material in Cairns,
Australia (Cairns3) was used as an additional negative control.
Mosquitoes were fed an artificial blood meal spiked with
DENV-2 in four independent experiments to examine possible
interactions with Wolbachia. The presence of DENV-2 in whole
mosquito bodies was examined 7 and 14 days post exposure
using a cell culture enzyme immunoassay (CCEIA) (Knox et al.,
2003). In three separate experiments no Wolbachia-infected
mosquitoes (PGYP1.out) tested positive for DENV-2, but
DENV-2 infection rates in Wolbachia-uninfected mosquitoes
(PGYP1.out.tet and Cairns3) ranged from 30%–100% (Table 1,
Exp 1–3). Body viral infection rates in PGYP1.out.tet mosquitoes
ranged from 30%–100% after 7 days and 48%–97% after
14 days, while the body viral infection rates in Cairns3 ranged
from 50%–95% after 7 days and 57%–95% after 14 days. The
disseminated viral infection rates measured through the presence
of virus in mosquito legs in tetracycline-treated A. aegypti
ranged from 10%–23% and 37%–43% after 7 and 14 days,
respectively. Disseminated infections in the Wolbachia-free
wild-type Cairns3 strain of A. aegypti ranged from 5%–13%
and 20%–33% after 7 and 14 days, respectively (Table 1)(p<
0.001, chi-square). In one experiment (Table 1, Exp 4) when
mosquitoes were fed the highest titer (107.8 Logs) of DENV-2
a small number of Wolbachia-infected mosquitoes tested positive
for DENV-2 at both 7 and14 days post infection (5 and 8%,
respectively) but this was significantly fewer than Wolbachia
uninfected controls (63%–78% and 70%–75%, respectively)
(p < 0.001, chi-square).
To provide a more conservative test of Wolbachia-mediated
interference, mosquitoes were intrathoracically injected with
DENV-2. These experiments circumvented the midgut barrier
to infection (Woodring et al., 1996) and allowed for the delivery
of a repeatable inoculating dose (around 2,750 infectious particles/
mosquito) of DENV-2 that produced consistent high-titer
infections in control mosquitoes. Accumulation of genomic
(+RNA) and anti-genomic (-RNA) RNA strands was assessed at
5 and 14 days post injection by quantitative real time PCR using
DENV-2 specific primers (Richardson et al., 2006). At both time
points, the amount of DENV-2 RNA present was reduced by
up to 4 logs in both the PGYP1 and PGYP1.out Wolbachiainfected
mosquito strains compared to their paired tetracycline
treated counterparts (Figure 1, and Table S1 available online).
Furthermore, when mosquito saliva collected from mosquitoes
Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc. 1269
Figure
1.
Quantitative
PCR
Analysis
of
Dengue
Virus
in
Mosquitoes
Two strains of Wolbachia-harbouring (+ Wolb) A. aegypti mosquitoes (PGYP1 and PGYP1.out) and their tetracycline treated counterparts (-Wolb) (PGYP1.tet and
PGYP1.out.tet) were intrathoracically injected with DENV-2 and the virus RNA was estimated by real-time PCR.
(A) Genomic RNA (+RNA) in thorax and head 5 days post-infection (dpi), abdomen 5 dpi and whole mosquito 14 dpi.
(B) Anti-genomic RNA (-RNA) in thorax and head 5 dpi, abdomen 5 dpi and whole mosquito 14 dpi. Bars represent grand means ±
SEM calculated across four
independent replicate experiments. *p < 0.05 by Mann-Whitney U test. See also Table S1.
14 days postinjection was tested for the presence of infectious
virus by CCEIA, none of the Wolbachia-infected mosquitoes
samples tested positive for virus (data not shown). A dramatic
reduction in viral protein synthesis was also observed by immunofluorescent
microscopy (IFA) (Figures 2A–2F) and western blot
analysis (Figure S1).
Double immunofluorescent staining of paraffin sections of Wolbachia-
uninfected control mosquitoes 14 days post-injection
showed DENV-2 infection predominantly in mosquito fat body,
ommatidia (Figures 2A–2F) and nervous system. DENV-2 was
not detected in any of these tissues in Wolbachia-infected
mosquitoes (PGYP1 and PGYP1.out) whereas Wolbachia was
clearly visible in the fat tissue, ommatidia (Figure 2), brain, ovaries,
and malpighian tubules. Only in a few rare individuals was DENV2
detected in patches of fat tissue in PGYP1.out mosquitoes.
However in these cases Wolbachia and DENV-2 were not
co-localized in the same cells and DENV-2 was only seen in occasional
patches of cells that were not infected with Wolbachia
(Figure 2G). The presence of DENV-2 in some injected PGYP1.out
mosquitoes was also confirmed by western blot (Figure S1A).
Wolbachia
and
Chikungunya
Virus
We then went on to determine if the virus interference phenotype
would extend to the alphavirus CHIKV. The virus strain used in
the experiments contained the Ala to Val mutation in the
membrane fusion glycoprotein E1 gene (E1-A226V), which has
been linked to increased infectivity in A. albopictus (Tsetsarkin
et al., 2007). An Australian population of A. aegypti was recently
shown to also be a highly efficient laboratory vector of this virus
strain (van den Hurk et al., 2009).
Mosquitoes were exposed to a blood/virus mixture containing
106.4 CCID50/ml of CHIKV, and at various time points postexposure,
mosquitoes were processed to quantify the number of viral
RNA copies using qPCR and CHIKV-specific primers and probes
(van den Hurk et al., 2009). Immediately after feeding, the number
of CHIKV genomic (+ RNA) RNA copies in the body and head were
comparable for all three lines, suggesting that they imbibed
similar amounts of virus (Table 2). The median number of copies
decreased in all three lines on day 2, prior to it increasing in the
PGYP1.out.tet and Cairns3 mosquitoes to its highest level at
day 14-postexposure. Day 14 infection rates were 87% and
79% for the PGYP1.out.tet and Cairns3 controls and 17% for
the Wolbachia infected PGYP1.out line (p < 0.001, chi-square).
In all three mosquito groups, CHIKV RNA was detected in the
legs and wings immediately after feeding (Table 2). This may
represent either direct contact between the legs and/or wings
and the blood/virus mixture or a rupture of the mesenteron,
which released virus directly in the hemolymph (Turell, 1988).
After day 0, CHIKV was not detected in the legs and wings of
any PGYP1.out (+ Wolb) mosquitoes. In contrast, on all days
postexposure, virus was detected in the legs and wings of
PGYP.out.tet and Cairns3 control mosquitoes (-Wolb) and by
day 14, the virus was detected in the legs and wings of 100%
and 90%, respectively, of mosquitoes that had positive bodies
and heads (p = 0.125, chi-square).
Wolbachia
and
Plasmodium
Considering that the viral interference effect appeared robust
for two unrelated arboviruses we then tested the effect on the
protozoan parasite P. gallinaceum. While not a human pathogen,
1270 Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc.
this species of malaria parasite is known to be able to infect A.
aegypti mosquitoes in the laboratory. Since no species of anopheline
mosquitoes are known to carry natural Wolbachia infections
and stable Wolbachia transinfected lines have yet to be
generated, we considered the A. aegypti – P. gallinaceum model
system most appropriate for testing effects on malaria parasites.
Wolbachia-infected and uninfected A. aegypti mosquitoes
(PGYP1.out and PGYP1.out.tet strains) as well as a susceptible
strain of Aedes fluviatilis were fed in parallel on P. gallinaceum infected
chickens. A. fluviatilis has a broad geographical distribution
in Latin America and has been used in the laboratory as
Figure
2.
Localization
of
Wolbachia
and
Dengue
Virus
in
A.
aegypti
Mosquitoes
Double immunofluorescence staining of mosquito
sections showing the localization of dengue virus (red)
and Wolbachia (green). Sections were probed simultaneously
with polyclonal anti-wsp antibody (Wolbachia)
and monoclonal anti-DENV antibody 4G4, followed by
Alexa 488 (green) and Alexa 594 (red) conjugated
antibodies, respectively. DNA (blue) is stained with DAPI.
In panels (A, B, E, F, and G), the red, green and blue
channels are merged. C and D show only red and green
channels merged. (A, C, E) PGYP1.tet (-Wolb) mosquitoes,
14 days post-DENV-2 thoracic injection. Dengue
virus is visible in ommatidia cells (A and C) and fat tissue
(E). (B, D, F) PGYP1 mosquitoes (+ Wolb), 14 days postDENV-
2 thoracic injection. Wolbachia can be seen in
ommatidia cells and brain (B and D) and fat tissue (F). In
contrast no dengue virus was detected. (G) Cellular exclusion
of DENV-2 by Wolbachia. The presence of both
Wolbachia and DENV-2 was observed at very low
frequency in a small number of Wolbachia-infected outcrossed
mosquitoes, 14 days post-DENV-2 injection.
Dengue is only apparent in cells lacking Wolbachia
however. Scale bars: A-D, G: 50 mm; E, F: 20 mm. See
also Figure S1.
a safe avian malaria (P. gallinaceum) model
vector, as it does not naturally transmit DENV
or yellow fever virus (Tason de Camargo and
Krettli, 1981).
Seven days post-feeding on infected
chickens, mosquito midguts were dissected
and presence and number of Plasmodium
oocysts assessed. The wMelPop-CLA infection
significantly reduced (p < 0.0001, chi-square)
the frequency of mosquitoes in the population
infected with at least a single oocyst and so
potentially able to transmit Plasmodium (Figure
3A) from 74% (tet controls) down to 42%.
The presence of Wolbachia also reduced the
number of oocysts present in mosquitoes that
were infected with the parasite (Figures 3A and
3B). To quantify the difference in parasite loads,
15 days after infection mosquitoes were
collected and the DNA was extracted. The relative
abundance of Plasmodium genomic DNA
was measured by qPCR of the 18S ssu rRNA
gene (Schneider and Shahabuddin, 2000) and
normalized to the mosquito Actin gene. The results showed the
same pattern of interference as observed from oocyst count
data. In PGYP1.out mosquitoes Plasmodium genomic DNA
was 26-fold less abundant than in PGYP1.out.tet lines
(Figure 3C). Immunofluorescence analysis using an anti-CSP
(Plasmodium circumsporozoite protein) monoclonal antibody
showed the presence of mature oocysts in both mosquito
species (Figure S2B), but very rarely in Wolbachia-infected
mosquitoes.
When we incubated the mosquito sections with an anti-
Wolbachia (wsp) antibody we serendipitously discovered
Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc. 1271
Table2.EffectofWolbachiaonCHIKVinfectionPGYP1.out PGYP1.out.tet Cairns3
Dayspost-infection
Infected(%)
Disseminated(%)
Median copiesin Bodies/
Heads (N)
Percentiles(25 -75%)
Infected(%)
Disseminated(%)
Median copiesin Bodies/
Heads (N)
Percentiles(25 and 75%)
Infected(%)
Disseminated(%)
Median copiesin Bodies/
Heads (N)
Percentiles(25 and 75%)
0 100 20 10.2 (10) n.s. 10.0-10.4 100 20 10.2 (10) 9.8-10.6 100 10 10.0 (10)n.s. 9.8-10.5
2 80 0 9.1 (8)n.s. 8.5-9.4 50 30 9.6 (5) 9.3-10.2 70 40 9.5 (7)n.s. 9.2-9.8
4 20 0 7.8 (2)* 7.3-8.2 60 60 10.4 (6) 9.7-10.8 50 30 10.0 (5)n.s. 9.6-11.7
7 10 0 7.3 (1)n.a. n.a. 100 100 11.1 (10) 10.8-11.3 100 90 10.39 (10)* 8.4-10.8
10 0 0 (0)n.a. n.a. 60 60 10.8 (6) 10.6-10.9 90 90 10.6 (10) n.s. 10.4-11.3
14 17 0 7.7 (3)** 6.7-8.0 85 100 11.8 (26) 10.9-11.9 80 90 11.3 (23)* 10.3-11.6
A. aegypti were orally infected with fresh CHIKV and viral load (Log10) determined by quantitative RT-PCR in bodies and heads or wings/ legs (for viral dissemination). Median copy number isbased only on mosquitoes that were positive for virus. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 by Mann Whitney-U tests for the comparisons of PGYP1.out and Cairns3 each against PGYP1.out.tet.
n.s., nonsignificant; n.a., not applicable.
a Wolbachia infection in A. fluviatilis mosquitoes indicating that
this species of mosquito was naturally infected with Wolbachia.
PCR using Wolbachia general wsp primers (Braig et al., 1998;
Zhou et al., 1998) amplified a fragment from all A. fluviatilis
tested. Sequence of the amplified DNA indicated that this Wolbachia
strain (named wFlu) belongs to the Wolbachia B supergroup
and is distantly related to wMelPop-CLA. qPCR analysis
revealed that the density of wFlu in A. fluviatilis is about 20-fold
lower than the density of wMelPop-CLA in A. aegypti (Figure S3).
We then examined the tissue localization of Wolbachia in both
mosquito species and whereas wMelPop-CLA is distributed
throughout most tissues of the mosquito including the fat
body, anterior midgut, muscle, nervous tissue, malpighian
tubules and ovaries, wFlu is present only in ovaries, malpighian
tubules and less frequently in the head, but absent from ommatidia
(Figures 4 and S3).
Immunity
Genes
To examine whether resistance of Wolbachia infected mosquitoes
to pathogen infection may be related to stimulation or
priming of the mosquito innate immune system, we quantified
the expression of a sample of immune genes. It was recently
demonstrated that some immune genes are differentially regulated
in A. aegypti mosquitoes infected with dengue virus (Xi
et al., 2008). Interestingly, regulation of the immune pathway
genes in these mosquitoes was also stimulated by their natural
gut microbiota and rearing mosquitoes aseptically, and so
depleting their bacterial flora, resulted in a 2-fold increase of
dengue virus in the midgut (Xi et al., 2008). We chose a subset
of the genes that were shown to be upregulated upon dengue
virus infection to assess the effect of Wolbachia infection on
the mosquito immune system.
The expression levels of eleven immune pathway genes in the
wMelPop-CLA infected PGYP1.out and its uninfected control
line were compared for two independently reared cohorts of
mosquitoes (Figure 5). In each of the experiments four genes encoding
representatives of the immune effector molecules cecropin,
defensin, thio-ester containing proteins (TEP) and C-type
lectins were significantly upregulated in the presence of
wMelPop-CLA, whereas FREP18 (fibrinogen-related protein
18) levels remained unchanged (Figures 5A and 5B). In contrast,
while a statistically significant (p < 0.05) differential mRNA
expression between mosquitoes with and without Wolbachia
was observed for a subset of the genes from the Toll, IMD
and Jak/STAT signaling pathways (Figure 5C Experiment 1Rel
1A and SOCS36E; Figure 5D Experiment 2 – IMD and
Rel 2) these differences were inconsistent across the two experiments,
suggesting that the variation between cohorts was
greater than any differences induced by Wolbachia. In addition,
in these cases the fold-change of mRNA expression was low
(below 2-fold), whereas the effector genes were induced as
much as 100-fold by the presence of Wolbachia (Figure 5A
and 5B). These results indicate that the presence of wMelPop-
CLA in mosquitoes stimulates expression of at least some
immune effector genes, although a clear stimulation of the classical
innate immune signaling pathways was not repeatably
identified.
1272 Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc.
DISCUSSION
The finding that the wMelPop-CLA Wolbachia infection reduces
the ability of two distantly related arboviruses and a malaria
parasite from establishing productive infections in the mosquito
shows that the pathogen interference effect of the wMelPop-
CLA strain is general and fundamental. The mechanism is
currently unclear although our data suggest that immune effector
genes are upregulated in the mosquito in the presence of the
wMelPop-CLA strain and are likely to play a role, even though
key components of the currently accepted signaling pathways
for these effectors do not seem to be transcriptionally modulated
by Wolbachia.
It is also possible that the observed interference effect might
relate to competition for key host cell components. This is supported
by the observation that DENV-2 infection was only
observed in Wolbachia infected mosquitoes in cells that lacked
the Wolbachia infection (Figure 2G). It is known, for example,
that insects need to obtain cholesterol and other fatty acids
from their diet (Blitzer et al., 2005) and that Wolbachia and related
bacteria also lack the biosynthetic capability to synthesize
cholesterol and need to obtain it from the host insect (Lin and Rikihisa,
2003; Wu et al., 2004). In addition cholesterol is known to
be a key fatty acid required for successful Flavivirus and Alphavirus
replication that must be obtained from the host cell (Lu
et al., 1999; Mackenzie et al., 2007). Similarly Plasmodium is
also known to depend on host lipids in the mosquito stage (Atella
et al., 2009). The relative importance of innate immune effectors
and alternative mechanisms such as competition for critical host
cell components such as cholesterol remains to be determined.
One critical paradox relating to Wolbachia infection and reductions
in mosquito vector competence is the observation that
some mosquito species that naturally carry Wolbachia infections
Figure
3.
Plasmodium
gallinaceum
Detection
in
Aedes
spp.
Mosquitoes
A. aegypti and A. fluviatilis mosquitoes were fed on
P. gallinaceum infected chickens and parasite was
detected.
(A) Box plots of median numbers and 25 (bar below
median) and 75 (above median) percentiles of oocyst
intensities, 7 days postinfection in wMelPop-CLA infected
(PGYP1.out, +Wolb) or uninfected (PGYP1.out.tet, -Wolb)
A. aegypti and in A. fluviatilis mosquitoes (***p < 0.0001 by
Mann-Whitney U test). Percentage of mosquitoes containing
at least one oocyst is shown above the graph.
(B) Mercurochrome staining of mosquito midguts showing
P. gallinaceum oocysts (arrows) in wMelPop (+Wolb) infected
and uninfected (-Wolb) and in A. fluviatilis mosquitoes,
seven days post-infection (1003
magnification).
(C) Quantitative PCR analysis 15 days after infection
showing the relative abundance of Plasmodium 18S ssu
rRNA sequences in comparison to Actin gene (**p <
0.005, ***p < 0.0001 by Mann-Whitney U test). See also
Figure S2.
such as A. albopictus are known to be competent vectors for
a range of pathogens including DENV and CHIKV. Our fortuitous
discovery that our control mosquito species A. fluviatillis
supports very high oocyst loads, despite the presence of a naturally
occurring Wolbachia strain, allowed us to provide an explanation
for this observation. It is known that different Wolbachia
strains commonly display quite variable somatic tissue distribution
and densities (Dobson et al., 1999; Dutton and Sinkins, 2004;
Miller and Riegler, 2006). Our analysis of A. fluviatilis shows that
the wFlu Wolbachia strain has a very restricted tissue tropism in
its host mosquito (Figures 2, 5, and S3) and overall Wolbachia
densities are much lower (20-fold) than the wMelPop-CLA infection
in A. aegypti (Figure S3A). This likely explains why no Plasmodium
interference effect is observed in this species and
may explain why A. albopictus is known to be a competent
vector for arboviruses while being naturally infected with Wolbachia.
The wMelPop Wolbachia strain in Drosophila is known to be
unusual in that it grows to high densities (Min and Benzer, 1997)
and has broad tissue tropism in A. aegypti (Figures 2 and 5),
which may underpin its ability to so effectively interfere with
both virus replication and parasite development.
Our results have significant implications for any future control
measure based on the use of life-shortening Wolbachia.
Currently the wMelPop-CLA infection has been demonstrated
to reduce average mosquito lifespan by approximately 50% in
the laboratory (McMeniman et al., 2009) that while sufficient to
greatly reduce transmission could still allow some mosquitoes
to live longer than the extrinsic incubation period for most human
pathogens. The observed interference effect reported here
appears sufficiently strong that it would act in conjunction with
the life-shortening effect to control arbovirus transmission.
Life-shortening effects on mosquitoes would become secondary
and only act on individuals that might escape the direct viral
Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc. 1273
Figure
4.
Wolbachia
Distribution
in
Aedes
spp.
Mosquitoes
Fluorescence in situ hybridization showing the localization of Wolbachia (in red) in different tissues of A. aegypti and in A. fluviatilis mosquitoes. Sections
were hybridized with two Wolbachia specific 16S rRNA probes labeled with rhodamine. DNA is stained with DAPI (blue). A green filter is used to provide contrast.
The top diagram has been adapted from (Jobling, 1987).
(A) Anterior part of the digestive system, showing the salivary glands (SG) and the cardia (C), together with the thoracic ganglion (G) of uninfected A. aegypti
(-Wolb), PGYP1.out (+Wolb) and A. fluviatilis mosquitoes. Panels B). Fat tissue showing the presence of wMelPop-CLA in PGYP1.out (+ Wolb) mosquitoes
but absence of the bacteria in PGYP1.out.tet (-Wolb) and in A. fluviatilis.C) wMelPop-CLA is present in the fat tissue (FT) surrounding the gut in PGYP1.out
interference effect. The combined action of two distinct Wolba-The inhibitory effect of wMelPop-CLA Wolbachia against
chia effects, lifespan reduction and virus interference, should P. gallinaceum is a promising step toward the possible applicaalso
reduce the risk of resistance formation to the strategy. tion of this strategy to control human malaria. Anopheles
1274 Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc.
Figure
5.
Immune
Gene
Regulation
in
Response
to
Wolbachia
Infection
RT-qPCR analysis of mRNA expression from selected immune genes of PGYP1.out and PGYP1.out.tet mosquitoes. Graphs show the target gene to housekeeping
gene ratio for the genes indicated from the immune pathways. Box plots of median numbers and 25 (bar below median) and 75 (above median)
percentiles of 10 individual mosquitoes from a single cohort. Results from two independently reared cohorts are shown (cohort 1 [A and C]; cohort 2 [B and
D]). Statistically significant medians by Mann Whitney-U test (*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001) are indicated. Fold-change for the gene is shown above
the box plots.
mosquitoes, as A. aegypti, are not naturally infected with Wolbachia,
therefore transinfection experiments into these vector
species are crucial to determine whether Wolbachia can also
block human malaria in anopheline vectors. As the bacterium
is able to establish somatic infection in the human malaria vector
Anopheles gambiae (Jin et al., 2009), it is likely that the same
interference effect may also be present when a stable infection
of Wolbachia becomes available.
EXPERIMENTAL
PROCEDURES
Mosquitoes
Five different A. aegypti lines were used including the original inbred wMel-
Pop-CLA infected line (PGYP1) and its tetracycline-cured counterpart
PGYP1.tet (McMeniman et al., 2009). A genetically diverse line derived
from PGYP1, named PGYP1.out was generated by backcrossing PGYP1
for three generations to F1 males of 52 independent field-collected isofemale
lines from Cairns, Australia. Two further generations of backcrossing
were conducted with F2 field-collected material (wild-type from Cairns,
Australia). The backcrossing scheme used here is expected to replace
96.9% of the original inbred genotype. A tetracycline-cured counterpart
(PGYP1.out.tet, -Wolb) was generated by antibiotic treatment of backcrossed
adults, followed by two generations of recovery and re-colonization
with gut bacteria as previously described (McMeniman et al., 2009). A genetically
diverse wild-type line was also generated at the same time from
field-collected material sourced from 245 ovitraps across seven suburbs
of Cairns, Australia in late 2008 and named Cairns3. For the malaria experiments,
a susceptible A. fluviatilis strain (Rodrigues et al., 2008) was used in
parallel with PGYP1.out (+ Wolb) and PGYP1.out.tet (-Wolb) A. aegypti
mosquitoes.
Insects were kept in a controlled environment insectary at 25
C,
80% RH,
12 hr light regime. Larvae were maintained with fish food pellets (Tetramin,
Tetra) and adults were offered 10% sucrose solution, ad libitum. Adult females
were bloodfed on human volunteers (UQ human ethics approval 2007001379;
QIMR approval P361) for egg production. Three-to five-day-old female
mosquitoes were used for the DENV and malaria infection experiments. Seven
day old females were used for the CHIKV experiments.
Viruses
Dengue
virus
Dengue virus serotype 2 (DENV-2) (92T) was isolated from human serum
collected from a patient from Townsville, Australia, in 1992. Virus stocks
were passaged five times in Aedes albopictus cell line (C6/36) grown in
RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), penicillin
(100 mg/ml), streptomycin (100 mg/ml), and 13
glutamax (Invitrogen), and
maintained at 28
C.
Supernatants from infected cell lines (C6/36) were collected 5 days after
infection, separated into 0.5 ml aliquots, and frozen at [1]80
C. Virus used in
microinjection experiments was obtained from thawed stocks of above and
had a titer of 107.6 CCID50 per ml. To prepare the DENV-2 for oral feeding,
the frozen virus stock was passaged once more through C6/36 cells and the
supernatant was harvested at 5 d and then mixed with blood to formulate
a bloodmeal for feeding. Virus solution with higher titer (108.85 CCID50/ml)
was obtained by harvesting the viral supernatant and the intracellular virus
from cell lysates.
Chikungunya
Virus
CHIKV strain 06113879, isolated from a viremic traveler returning from
Mauritius to Victoria, Australia in 2006 was provided by the Victorian Infectious
Diseases Research Laboratory, Melbourne, Australia. Cultures were grown at
37
C in Vero (African green monkey kidney) cells for 4 days before the supernatant
was harvested and frozen at [1]80
C. This CHIKV stock was passaged
once more in Vero cells and the virus was concentrated from 1.8 L of infected
culture supernatant via ultracentrifugation at 10 000 g for 17 hr at 4
C. Pelleted
virus was resuspended in 20 ml of Opti-MEM[1] reduced serum medium
(GIBCO BRL[1], Invitrogen, California) supplemented with 10% FCS before
aliquots of the prepared virus were frozen at [1]80
C. The stock concentration
had a final viral titer of 108.0 CCID50/ml.
Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc. 1275
Exposure
of
Mosquitoes
to
Viruses
Intrathoracic
Injection
with
DENV-2
Female mosquitoes were briefly anesthetized with CO2 and placed on a glass
plate over ice. Insects were handled with forceps under a dissecting scope
and injected into their thorax (pleural membrane) with a pulled glass capillary
and a handheld microinjector (Nanoject II, Drummond Sci.). 69 nl of DENV-2
stock was injected into each mosquito, which corresponds to approx. 2,750
virus particles/ mosquito. (See Supplemental Experimental Procedures for
details).
Oral
Feeding
with
DENV-2
and
CHIKV
Mosquitoes were starved for 24 hr and then transferred to 1L or 2.5L plastic
feeding containers. Prior to feeding, DENV-2 was harvested from C6/36 cell
culture supernatant and diluted 1:5 in defibrinated sheep’s blood. For the
CHIKV experiments, frozen aliquots of stock virus were rapidly thawed, and
diluted in washed defibrinated sheep blood and 1% sucrose. Blood-virus
mixtures were maintained at 37
C for 1 hr and 4 hr for DENV-2 and CHIKV,
respectively, using membrane feeders (Rutledge et al., 1964) and covered
with a porcine intestine as the membrane. After feeding, mosquitoes were
anesthetized using CO2 and partially or non-engorged mosquitoes were discarded
(see Supplemental Experimental Procedures for details).
Cell
Culture
Enzyme
Immunoassays
Titration of DENV-2 and CHIKV stocks and blood/virus mixtures was performed
using a CCEIA method (Broom et al., 1998). For DENV-2, C6/36 cell
monolayers (60%–90% confluent) in 96-well plates were inoculated with 50
ml/well of virus dilutions and plates were incubated at 28
C with 5% CO2 for
5 d. Cell monolayers were then fixed and examined for DENV-2 antigens using
a cocktail of flavivirus cross-reactive monoclonal antibodies (4G4 and 4G2)
(Clark et al., 2007; Gentry et al., 1982). For CHIKV, all titrations were performed
in Vero cells, which were incubated at 37
C with 5% CO2. After 7 days, plates
were examined for cytopathic effect (CPE), which was confirmed using the
CCEIA and the broadly reactive alphavirus monoclonal antibody, B10 (Broom
et al., 1998).
Plasmodium
gallinaceum
Two to three day-old White Leghorn chickens were infected through intra-peritoneal
or intradermal injection of Plasmodium gallinaceum 8A strain parasitized
blood (Rodrigues et al., 2008). Parasitemia was determined every other
day through Giemsa-stained blood smears. Ten microscopic fields were
examined under immersion oil to count one hundred red blood cells and determine
the ratio of infected cells. Presence of gametocytes and rising parasitemia
was ensured in order to enhance the chance of mosquito infection. Before
infection mosquitoes were deprived of sugar solution overnight and on the
next morning chickens were placed on top of the cages and mosquitoes
were fed for about 45 min. Only bloodfed female mosquitoes were kept for
further observations. Four independent experiments were performed with
independent cohorts. Seven days after bloodfeeding mosquitoes had their
midguts dissected in 1 PBS and after staining the midguts with 0.2% Mercurochrome
solution oocysts were counted under a microscope (DIC, 100X).
Fifteen days after infection mosquitoes were collected and DNA was extracted
(QIAGEN Blood & Tissue kit) for Plasmodium detection, using around 1 ng of
genomic DNA in quantitative PCR reactions. Primers for the Plasmodium
spp. 18S ssu rRNA gene (Schneider and Shahabuddin, 2000) were used for
parasite amplification and A. aegypti Actin was used as a host control gene
(primer sequences in Supplemental data). Analyses were performed with
qGENE (Joehanes and Nelson, 2008) and Mann Whitney-U tests (STATISTICA
V8, StatSoft, Inc.) to compare relative abundance between lines.
Quantitative
DENV
PCR
Analysis
Individual frozen mosquito bodies or body parts were placed into 2 ml screw
cap vials with a glass bead (2 mm diameter, Sigma-Aldrich). 200 ml of Trizol
(Invitrogen) was added and the sample homogenized for 150 s using a Mini
BeadBeater (Biospec Products). 40 ml of chloroform was added to each tube
and samples were thoroughly vortexed for 10 s. Tubes were centrifuged
for 15 min at 14,000 g and 4
C and the supernatant containing the RNA was
transferred to new tubes. RNA was precipitated with 40 ml of isopropanol,
washed with 200 ml of 70% ethanol and resuspended in 25 ml of RNase-free
milli-Q water. Samples were maintained at [1]80
C until further analysis (See
Supplemental Experimental Procedures for details).
CHIKV
RT-qPCR
Analysis
Individual frozen mosquito bodies and heads or legs and wings were homogenized
for 3 min in 1 ml of Opti-MEM[1]reduced serum medium using glass
beads and a mechanical homogenizer (Spex Industries, Edison, NJ). The
supernatant from each sample was removed for potential virus isolation and
stored at [1]80
C. The remaining mosquito pellet from each sample was resuspended
in 200 ml of Opti-MEM[1] reduced serum medium and TRIzol[1] LS
reagent (Invitrogen) and homogenized again as described above. After incubation
at room temperature for 5 min and addition of 40 ml of chloroform, the
entire homogenate for each sample was then vortexed for 15 s and transferred
to a pre-spun Phase Lock Gel Heavy tube (5 Prime, GmbH, Germany). The
lysed contents of each tube were allowed to settle for 5 min and organic and
aqueous phases were separated by centrifugation at 16,000 g for 10 min.
Aqueous phases were recovered from each tube before total RNA was
extracted using a modification of the RNeasy Mini Kit protocol (QIAGEN,
Australia) and on column-DNase treatment. RNA was eluted with 30 mlof
RNase-free H2O and a final centrifugation step for 1 min. RNA samples were
stored at [1]80
C prior to analysis by RT-qPCR. RNA standards were produced
for the relative quantification of CHIKV RNA copy numbers normalized to RNA
levels of the A. aegypti house-keeping gene RpS17 (See Supplemental Experimental
Procedures for details).
Immune
Genes
PGYP1.out and PGYP1.out.tet mosquitoes were analyzed by RT-qPCR for a
selection of immune genes. Two biologically independent cohorts of 10
sugar-fed, 5-6 day old, female mosquitoes were collected and analyzed
from each mosquito line. Total RNA was extracted from whole mosquitoes
using TRI REAGENT (Molecular Research Center, Inc.) or RiboZol (AMRESCO).
The RNA samples were DNase treated (Promega) and reverse
transcribed using random primers and SuperScript III Reverse Transcriptase
(Invitrogen). Quantitative PCR was carried out as per Platinum SYBR Green
protocol (Invitrogen). Primer sequences for REL1, REL2, CECG and DEFC
were obtained elsewhere (Xi et al., 2008) and the other primers were designed
using gene sequences obtained from VectorBase (see Supplemental data).
The temperature profile of the qPCR was 95
C for 2 min, 50
C for 2 min and
40 cycles of 95
C for 10 s, 60
C for 10 s and 72
C for 20 s. The house-keeping
gene RpS17 (Cook et al., 2006) was used to normalize expression. Target gene
to house-keeping gene ratios were obtained for each biological replicate
using QGene 4.2 (Joehanes and Nelson, 2008). Treatment effects on the
expression ratios were examined using Mann Whitney-U tests in STATISTICA
V8 (StatSoft, Inc.) and fold change was calculated by the REST method (Pfaffl
et al., 2002).
Immunofluorescence
Following the removal of legs and wings, 14 dpi mosquitoes were fixed overnight
at 4
C in 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, containing 0.5% (v/v) Triton
X-100. Fixed mosquitoes were dehydrated in an ethanol series of 50%–100%
ethanol, followed by two toluene treatments and then infiltrated with paraffin
wax (Paraplast-Xtra, McCormick Scientific) at 60
C. Paraffin-embedded
mosquitoes were sectioned using a rotary microtome to obtain 8 mm sections
that were adhered to superfrost plus slides (Menzel-Gla¨ ser). Slides were dried,
de-paraffinated in 100% xylene, rehydrated in an ethanol series and washed in
PBS-T before being blocked overnight in 2% (w/v) bovine serum albumin
(BSA) in PBS-T at 4
C. Sections were then incubated simultaneously for 1 hr
with anti-rabbit wsp (1:100) and anti-dengue (1:10) 4G4 or anti-Plasmodium
CSP (Krettli et al., 1988) antibodies (1:100) (both monoclonal, developed in
mouse), in blocking solution. Tissue sections were washed twice with PBS-T
and then incubated simultaneously with Alexa-conjugated secondary antibodies
(Alexa-488 developed in rabbit or Alexa-594, developed in mice,
respectively, Molecular Probes, Invitrogen) diluted 1:1000 each in blocking
solution for 1 hr at room temperature. After two washes in PBS-T, the slides
were incubated in DAPI for 10 min, rinsed in PBS-T and then mounted using
an antifading reagent (ProLong, Invitrogen). Immunostaining was analyzed
with a Zeiss Axio Imager II epifluorescence microscope equipped with an
1276 Cell 139, 1268–1278, December 24, 2009 ª2009 Elsevier Inc.
Axiocam camera, using the same exposure conditions for each filter channel.
Photos are representative of at least 10 mosquitoes of each treatment.
Fluorescence
In
Situ
Hybridization
Paraffin-embedded mosquitoes were sectioned and de-paraffinated as
described above. Sections were then dehydrated in an ethanol series
and hybridized overnight at 37
C in a hybridization buffer containing 4X
SSC, 50% formamide, 250 mg/ml dextran sulfate, 250 mg/ml poly(A),
250 mg/ml tRNA, 250 mg/ml salmon sperm DNA, 100 mM DTT and 0.53
Denhardt’s solution and 200 ngof Wolbachia specific 16S rRNAprobes
(W2: 50-CTTCTGTGAGTACCGTCATTATC-30 and W3: 50-AACCGACCCT
ATCCCTTCGAATA-30) labeled at the 30 end with rhodamine. Both probes
are 100% homologous to both wMelPop and wFlu. Following overnight hybridizations,
sections were washed twice in 1X SSC containing 10 mM DTT and
twice in 0.5X SSC containing 10 mM DTT for 15 min each at 55
C, followed
by a 10 min wash at 0.53
SSC containing 10 mM DTT and 1 mg/ml DAPI. Slides
were briefly rinsed in water, mounted using an antifading reagent (ProLong,
Invitrogen) and observed and photographed as described above.
SUPPLEMENTAL
DATA
Supplemental Data include three figures, one table, Supplemental Experimental
Procedures, and Supplemental References and can be found with
this article online at http://www.cell.com/supplemental/S0092-8674(09)
01500-1.
ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to Nichola Kenny and Wai Yuen Cheah for technical support
and Paul Addison and Amy Fong for help with mosquito histology. We are
also thankful to Roy Hall and Natalie Prow for providing the anti-dengue and
B10 antibodies, Antoniana Krettli for the anti-CSP antibody, and Jose´ Ribeiro
for useful discussions on saliva collection. We are particularly thankful for wild
caught mosquito material supplied by Petrina Johnson and Scott Ritchie. We
would like to thank FIOCRUZ -Brazil for the support on the malaria experiments.
We thank members of the O’Neill and McGraw laboratories for critical
reading of the manuscript. This research was supported by a grant from the
Foundation for the National Institutes of Health through the Grand Challenges
in Global Health Initiative of the Bill and Melinda Gates Foundation and the
National Health and Medical Research Council, Australia.
Received: September 17, 2009
Revised: November 2, 2009
Accepted: November 12, 2009
Published: December 24, 2009
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