Cell, Volume 139
Dados Complementares
A Symbiont Wolbachia em Aedes aegypti
Limites de Infecção por Dengue,
Chikungunya, e Plasmodium
Luciano A. Moreira, Inaki Iturbe-Ormaetxe, Jason A. Jeffery, Guangjin Lu, Alyssa T. Pyke,
Lauren M. Hedges, Bruno C. Rocha, Sonja Hall-Mendelin, Andrew Day, Markus Riegler, Leon
E. Hugo, Karyn N. Johnson, Brian H. Kay, Elizabeth A. McGraw, Andrew F. van den Hurk,
Peter A. Ryan, e Scott L. O'Neill
Figura S1 Wolbachia e / ou proteínas de dengue detectado em A. aegypti
mosquitos. Western blot mostrando a presença de Wolbachia e / ou
vírus da dengue em A. aegypti mosquitos infectados com DENV-2 usando wsp
anticorpo policlonal para detecção de Wolbachia e 4G4 anticorpos monoclonais para
DENV-2 de detecção. O estado da infecção esperado (Wolbachia ou DENV-2) de
os mosquitos utilizado é indicado acima de cada mancha. (A) 14 dias após torácica
dia da injecção com DENV-2, (B) 7 e 16 após a alimentação oral com DENV-2.
Figura S2 distribuição gallinaceum P. e maturação em Aedes spp.
mosquitos 7 e 14 dias após a infecção. A) DAPI (azul) coloração de um
oocistos (Oo) no intestino de um PGYP1.out (+ Wolb mosquito), 7 dias postinfection
(dpi) com Plasmodium falciparum. A presença de numerosas
wMelPop-CLA Wolbachia (vermelho) dentro das células de Malpighi é detectada por FISH. B)
Imunofluorescência de localização de duas oocistos maduros (vermelho Oo) entre
oocistos imaturos (Oo branco) no epitélio intestinal de A. fluviatilis, 7dpi com P.
gallinaceum. C, D) Imunofluorescência mostrando a presença de P. maduro
esporozoítos gallinaceum (SP, vermelho) na glândula salivar (SG) e gut epitélios
de A. fluviatilis, 15 dpi.
Figura wMelPop S3-CLA e wflu Wolbachia densidade e distribuição em
Aedes spp. mosquitos. [A] Caixa de números de parcelas e 25 e mediana de 75%
percentis de número de cópias por Wolbachia mosquito, com base na norma
análise da curva para o gene wsp. wMelPop-CLA estirpe PGYP1.out infectados
(+ Wolb) ou não infectados PGYP1.out.tet (-Wolb) cepas de A. aegypti e A.
fluviatilis mosquitos (*** P <0,0001 por Mann-Whitney U). [B] A primeira
coluna (A, E, I) mostra a localização do wMelPop-CLA (E) e wflu (I)
Wolbachia (verde) do A. aegypti e A. fluviatilis cabeças. Ambos Wolbachia
estirpes são localizados por imunofluorescência usando um específico Wolbachia
anticorpos policlonais anti-wsp e visualizados usando o coelho-Alexa 488 (verde). B,
C, D) FISH mostrando a ausência de Wolbachia na musculatura torácica, desenvolvimento
oócitos e túbulos de Malpighi de mosquitos infectados. F, G, H)-wMelPop
CLA Wolbachia está presente em altas densidades na musculatura torácica, embriões,
túbulos de Malpighi (MT), tecido adiposo (FT) e ao redor do intestino médio (mg) de
Mosquitos PGYP1.out (+ Wolb), indicado por setas. J, K, L) wflu Wolbachia
está ausente no músculo torácico de A. fluviatilis (J), mas está presente na enfermeira
células (NC), parte apical de embriões (E) e nos túbulos de Malpighi (MT),
embora as densidades são muito inferiores aos observados para wMelPop -
CLA-A. aegypti transinfected (+ Wolb). IFA Micrografias (A, E, I), foram tomadas
utilizando um filtro para Alexa 488 (verde, Wolbachia), Alexa 594 (contraste) e DAPI
(DNA, azul) e, em seguida, mesclado. Micrografias PEIXE (B, D, F, H, J-L) foram tomadas
utilizando um filtro para Alexa 488 (contraste), Alexa 594 (vermelho, Wolbachia) e DAPI
(DNA, azul) e, em seguida, mesclado.
Tabela S1 Quantificação do DENV-2 RNA após a injeção intratorácica em
diferentes linhas de mosquito. Dados de quatro experimentos independentes.
Experiência DPIA Line
Mosquito
MAPA
Significar
Cópias
SEMC
n
Genômica (+) RNA
1 5 T PGYP1 + H 48,58 28,71 5
PGYP1.tet T + H 21368,13 1998,85 5
PGYP1.out T + H 40,69 9,36 5
PGYP1.out.tet T + H 9064,83 2033,46 4
PGYP1 Abd. 6,44 6,44 5
PGYP1.tet Abd. 6357,29 684,98 5
PGYP1.out Abd. 2,22 2,22 5
PGYP1.out.tet Abd. 10753,91 3840,28 4
1 14 PGYP1 Whole 25,24 4,07 2
PGYP1.tet Whole 211350,19 38687,90 8
PGYP1.out Whole 16,48 3,25 7
PGYP1.out.tet Whole 231296,71 35561,87 8
2 5 T PGYP1 + H 32,16 5,62 4
PGYP1.tet T + H 50433,40 9985,28 5
PGYP1 Abd. 10,58 2,77 4
PGYP1.tet Abd. 10511,37 2342,27 5
2 14 PGYP1 Whole 28,39 24,95 8
PGYP1.tet Whole 269158,77 79320,07 7
3 5 T PGYP1 + H 67,45 28,53 5
PGYP1.tet T + H 105011,05 8693,71 5
PGYP1.out T + H 4406,69 4207,19 5
PGYP1.out.tet T + H 91941,97 33514,55 5
PGYP1 Abd. 48,46 4,51 5
PGYP1.tet Abd. 104850,10 21403,17 5
PGYP1.out Abd. 1907,65 1851,03 5
PGYP1.out.tet Abd. 24685,36 12919,93 4
3 14 PGYP1 Whole 4934,45 1164,91 7
PGYP1.tet Whole 360293,19 44383,67 7
PGYP1.out Whole 10576,99 8870,23 7
PGYP1.out.tet Whole 374720,72 69313,16 7
4 5 T PGYP1 + H 222,85 216,20 5
PGYP1.tet T + H 58325,94 17090,05 5
PGYP1.out T + H 25,39 6,15 5
PGYP1.out.tet T + H 44368,94 8846,02 5
PGYP1 Abd. 0 0 5
PGYP1.tet Abd. 9921,17 3210,77 5
PGYP1.out Abd. 0 0 5
PGYP1.out.tet Abd. 18377,48 7324,38 5
4 14 PGYP1.out Whole 19,02 6,05 7
PGYP1.out.tet Whole 173642,11 31279,92 7
Anti-genômica (-) RNA
1 5 T PGYP1 + H 3,31 1,43 5
PGYP1.tet T + H 2894,63 415,72 5
PGYP1.out T + H 2,71 0,67 5
PGYP1.out.tet T + H 2085,81 441,10 4
PGYP1 Abd. 2,02 2,02 5
PGYP1.tet Abd. 1787,10 324,89 5
PGYP1.out Abd. 3,58 1,86 5
PGYP1.out.tet Abd. 2659,96 921,85 4
1 14 PGYP1 Whole 2,30 0,48 2
PGYP1.tet Whole 30003,31 5917,62 8
PGYP1.out Whole 1,89 0,42 7
PGYP1.out.tet Whole 22630,82 3203,45 8
2 5 T PGYP1 + H 10,10 3,26 5
PGYP1.tet T + H 1792,76 566,52 5
PGYP1.out T + H 44,60 16,31 4
PGYP1.out.tet T + H 7507,95 1947,03 5
PGYP1 Abd. 3,31 1,16 4
PGYP1.tet Abd. 2720,41 948,94 5
PGYP1.out Abd. 23,45 4,05 4
PGYP1.out.tet Abd. 7217,09 3314,48 5
2 14 PGYP1 Whole 560,26 512,60 8
PGYP1.tet Whole 31931,67 9092,21 8
3 5 T PGYP1 + H 28,47 9,64 5
PGYP1.tet T + H 9172,11 2363,80 5
PGYP1 Abd. 35,24 3,88 5
PGYP1.tet Abd. 31911,28 8267,71 5
3 14 PGYP1 Whole 2096,00 752,44 8
PGYP1.tet Whole 72146,55 9500,18 8
PGYP1.out Whole 18011,17 11279,89 8
PGYP1.out.tet Whole 55719,18 8865,57 8
4 5 T PGYP1 + H 7,97 6,06 5
PGYP1.tet T + H 4389,66 956,66 5
PGYP1.out T + H 2,31 0,52 5
PGYP1.out.Tet T + H 4977,24 983,62 5
PGYP1 Abd. 0 0 5
PGYP1.tet Abd. 3108,85 510,51 5
PGYP1.out Abd. 1,57 1,57 5
PGYP1.out.Tet Abd. 4643,40 465,31 5
4 14 PGYP1.out Whole 12,16 4,19 8
PGYP1.out.Tet Whole 29279,24 3677,83 8
um DPI = dias pós-infecção
b T + H = Mosquito Tórax + Head; Abd .= Abdomen
c EPM = Erro Padrão de Meios
Suplementar Procedimentos experimentais
Exposição de mosquitos com vírus
Intratorácica injecção com DENV-2
Após a injeção de mosquitos foram transferidos para gaiolas de plástico dentro de 1L
caixas de isopor e estas caixas foram mantidas dentro de um
ambientalmente controlada incubadora 12:12 (L: D) h, 27oC e 70% RH.
Solução de sacarose e fatias de maçã foram fornecidos em cima de cada gaiola.
Os mosquitos foram coletados em cada gaiola, 5 e 14 d após a infecção e 5
dpi (dias pós-infecção) amostras foram dissecados no abdômen e no tórax
acrescido de cabeça. As amostras foram colocadas em gelo seco e depois transferidas para -80 ° C até
Extração de RNA.
Quatorze dias após a injeção torácica oito mosquitos foram coletados em
cada gaiola, momentaneamente anestesiados com CO 2 e colocado em uma placa de vidro sobre o gelo.
Asas e pernas foram removidos com pinça e suas peças bucais foram
introduzido um pedaço de tubulação de 1 centímetro de polipropileno (mm 0,61 x 0,28,
Microtube extrusões, NSW, Austrália) preenchida com óleo mineral (Novak et al.
1995). As fêmeas foram autorizados a salivar para estes capilares durante 5 minutos a
temperatura ambiente e, em seguida os capilares foram lavadas em 20 l de fetal bovino
soro com uma seringa de Hamilton. As amostras foram centrifugadas a 14.000 g por 2
minutos e mantido congelado (-80 ° C) para detecção de vírus mais usando uma cultura de células
imunoenzimático (CCEIA). Mosquito corpos inteiros foram congelados a seco
gelo e mantido a -80 ° C para a detecção do vírus da PCR quantitativo.
Oral Feeding com DENV-2 e CHIKV
Após a infecção, os mosquitos totalmente ingurgitadas foram mantidos em sacarose 15%
solução às 12:12 (L: D) H, 27-28oC e 70% RH. Para determinar DENV-2
infecção e as taxas de difusão, até 40 mosquitos foram processados
separadamente, aos 7 e 14 d pós-exposição. Para acompanhar a replicação e
divulgação de CHIKV, 10-30 mosquitos foram processadas nos dias 0, 2, 4,
7, 10 e 14 de pós-exposição. Os mosquitos foram anestesiados com CO 2, e
as pernas (por DENV-2) e pernas e asas (para CHIKV) de cada mosquito
foram removidas, e destes com o restante do corpo e da cabeça foram armazenados
separadamente a-80oC. As amostras foram processadas utilizando o método CCEIA
(DENV-2) ou qRT-PCR (CHIKV) descritos abaixo. Diferenças na
freqüência de infecção por DENV-2 e difusão entre as linhas de mosquito
foram analisados através do qui-quadrado de bondade de ajuste após os testes d 7 ou 14
período de incubação extrínseco para DENV-2 e 14d para CHIKV (Zar, 1999).
DENV PCR quantitativo
síntese do DNA foi baseada no protocolo descrito por Richardson
(Richardson et al., 2006), o que nos permitiu determinar tanto a genômica (+
RNA) e replicativa (anti-genômica formas) vírus (- RNA). Resumidamente, 0,5 mg de
cada RNA (2 g de amostras de saliva) foi misturado com 0,625 mM de ambos os
Primer DENV-2 NS5 frente ou para trás (veja a lista iniciadores) acrescido de 0,2 mM dNTPs
em separar as reações do DNA. As amostras foram incubadas a 86 ° C por 15 min e
5 min no gelo, em seguida, 5X Buffer primeira vertente e 100U de Superscript III
(Invitrogen) foi adicionado a um volume total de 20 l. As amostras foram incubadas a
25 ° C por 10 min, seguido de 42 ° C por 50 min e 10 min a 95 ° C para inativar
transcriptase. Os controlos negativos (sem modelo) foram incluídos em cada
reação.
Para detecção de DENV-2, as amostras de DNA foram diluídas 1:10 com água mili-Q.
A reação qPCR consistiu em 2 l de cDNAs diluída, 5 μl de Sybr Verde
Mix (Invitrogen) e 1 mM de cada primer (veja acima), em 10 volumes μl total.
As reações foram realizadas em duplicata em um rotor gene térmica termociclador
(Corbett Life Sciences), com as seguintes condições: 50 ° C 2min, 95 ° C 2min,
45 ciclos (95 ° C 5 S, 60 ° C 5 S, 72 ° C 10 s), seguida por uma curva de fusão (68 ° C
a 95 ° C) para verificar a especificidade. Uma curva padrão foi criado através da clonagem
DENV-2 fragmento NS5 em pGEM ®-T Easy (Promega). Após linearização com
Pst I plasmídeo foi diluídas em concentrações conhecidas e executados em
Paralelamente, a fim de determinar o número absoluto de DENV-2 cópias de cada
amostra. Mann-Whitney U foram utilizados (STATISTICA V8, StatSoft,
Inc.) para examinar o efeito da infecção por Wolbachia no número de dengue para cada
para cada combinação tensão emparelhados (PGYP1 x PGYP1.tet; PGYP1.out x
PGYP1.out.tet) parte do corpo x (inteiros, abdômen, tórax) x idade (5 ou 14 d) post
inoculação. Os testes foram baseados no meio de cada um dos 4 independente
experimentos replicados.
Western blot analysis
De proteína total de 5 mosquitos de cada tratamento foi extraído com proteínas
tampão de lise contendo 50 mM Tris pH 7,4, 140 mM NaCl, 0,5% (v / v) Triton X -
100, 1.5μg/ml DNAse I e inibidores da protease (Roche). As amostras foram fervidas
por 10 min na presença de tampão de carregamento da proteína, executado em 12% Laemmli
SDS gel e transferido para uma membrana de nitrocelulose (Immobilon-P,
Millipore) através do semidry Transblot SD (BioRad). Porque o antidengue 4G4
anticorpo reconhece um epitopo conformacional, β-mercaptoetanol
foi omitida do tampão de carregamento da amostra. Membranas foram bloqueadas com
5% não-leite em pó gordo em TBS-T overnight a 4 ° C, e em seguida, sondou com antiwsp
anticorpo policlonal (Braig et al., 1998) (diluído 1:1.000 em 5% (w / v) skim
leite em TBS-T) ou anti-dengue (4G4) anticorpo monoclonal (diluição 1:100) para
1h em temperatura ambiente. Após 3 lavagens em TBS-T, as membranas foram
incubadas com anti-rabbit or anti-mouse IgG fosfatase alcalina conjugada
antibody (Sigma) (1:4,000) para 1h, respectivamente. Na sequência de lavagem em TBS-T
borrões foram desenvolvidos com NBT / BCIP (Promega). Western blot em
Wolbachia-mosquitos infectados revelou uma única banda em torno de 26 kDa que
corresponde com o peso correto molecular de wsp (25.540 Da) (Braig et al.
1998), enquanto que o anticorpo 4G4 revelou uma banda de cerca de 50 kDa em
mosquitos da dengue, positivo.
Wolbachia densidade de Aedes spp. mosquitos
Uma curva padrão foi criado por clonagem de um fragmento do gene Wolbachia wsp
(Braig et al., 1998) em pGEM ®-T Easy (Promega). Após linearização com Pst I
o plasmídeo foi diluídas em concentrações conhecidas e correr em paralelo,
a fim de determinar o número absoluto de cópias Wolbachia contidas
cada amostra de mosquitos. Mann-Whitney U foram utilizados (STATISTICA
V8, StatSoft, Inc.) para analisar a densidade de Wolbachia em ambos os mosquitos
espécies.
A amplificação de seqüências de Wolbachia em A. fluviatilis
A superfície Wolbachia wsp gene da proteína foi amplificado utilizando os iniciadores 81F
e 691R que amplificam uma ampla gama de estirpes de Wolbachia (Braig et al., 1998).
Condições de ciclagem de PCR foram as seguintes: 94 ° C 3 min, (94 ° C 30 S, 52 ° C, 30 s,
68 ° C 90 s) x 35 ciclos, em seguida, 68 ° C 10 min. A mistura de reação continha 625
nM de cada primer, 125 mM dNTPs, 1,5 mM MgSO4, 20 ng de DNA do mosquito
e 0,5 L de prova de leitura Elongase mistura de enzimas (Invitrogen) em uma final
volume de 25 mL. Os produtos da PCR foram separados em géis de agarose a 1% e
corado com brometo de etídio.
Seis fragmentos independentes PCR foram clonados no pGEM ® T Easy vector
(Promega) e seis clones foram seqüenciados com T7 e M13R universal
primers utilizando o AB Big Dye terminator versão 3.1 do kit com fluorescentes
seqüenciamento (FS), AmpliTaq DNA polimerase (Perkin-Elmer) e analisadas em
(AB) 3730xl -96 seqüenciador capilar. O seqüenciamento foi feito na Austrália
Genome Research Facility (AGRF). Pesquisas similaridade de seqüência foram
realizada utilizando o algoritmo BLAST (Altschul et al., 1997) no NCBI, e um
árvore filogenética foi construída com DNAstar (Lasergene). A wsp parcial
seqüência do gene da wflu foi depositada no GenBank (Adesão
GQ917108 número).
Quantificação relativa do número de cópias de RNA CHIKV
Normas de RNA foram produzidos para a quantificação relativa de CHIKV RNA
copiar números normalizados para os níveis de RNA do A. aegypti ribosomal
RpS17 gene das tarefas domésticas. Em primeiro lugar, uma CHIKV transcrição do RNA sintético foi
produzidas por RT-PCR a amplificação de um fragmento de 588 pb da CHIKV
06113879 tensão usando oligonucleotídeos desenhados a partir do seu deduzida parcial E1 estruturais
seqüência do gene (GenBank number EU404186). A um passo-RTPCR
foi realizada utilizando o sobrescrito ® III One-Step RT-PCR System com
Platinum ® Taq High Fidelity (Invitrogen Life Technologies, Califórnia)
de acordo com as instruções do fabricante, com 400 nM de cada primer e 5
CHIKV μl de RNA em um volume final de reação de 50 ll. Amplificação foi
realizada em um gradiente Mastercycler Eppendorf (Eppendorf, Alemanha) e
incluíram um ciclo a 50oC por 15 min para a transcrição reversa, uma inativação
etapa de 94oC por 2 min, 40 ciclos de 94oC por 2 minutos, 30 segundos para 59oC e 68oC
por 2,5 min e extensão final a 68oC por 5 min. DNA amplificado foi purificado
usando o QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen, Austrália) e fornecidos
instruções e então clonado no vetor plasmidial pGEM ®-T Easy
(Promega). Após a presença e orientação do DNA da inserção foi verificada
por seqüenciamento de nucleotídeos, o plasmídeo foi linear para in vitro RNA
transcrição por digestão com Spe I. transcrições Synthetic RNA foram então
elaborado com base nas Riboprobe ® T7 System (Promega), antes de múltiplas
tratamentos com DNase I (RQ1 RNase-Free DNase; Promega Corporation, WI,
E.U.A.). A transcrição CHIKV final de 654 pb foi armazenado em alíquotas de uso único
at-80oC e os níveis de RNA foram determinadas por espectrofotometria de imediato
antes do uso. Para o gene housekeeping RpS17 padrão de RNA, o RNA total
de A. aegypti mosquitos todo foi extraído, como antes, com a exceção
que o tratamento DNase coluna foi omitido. Neste caso, o RNA foi
DNase tratados e armazenados como descrito para a transcrição do RNA CHIKV.
Para permitir uma comparação direta dos números de cópia CHIKV RNA no preparados
organismo do mosquito, mais cabeça e pernas além de amostras de asas, duas uma etapa específica
qRT-PCR real-time ensaios TaqMan ® foi desenvolvido visando a E1 CHIKV
e genes de A. aegypti RpS17 respectivamente. Ambos foram realizados utilizando o ABI
7500 Fast Real-Time PCR System (PE Applied Biosystems, Foster City,
Calfornia) e todas as misturas de reacção, os parâmetros de amplificação, análise dos resultados e
CHIKV primer e seqüências de sonda foram usados como relatado previamente.
Primers e sonda rotulada dupla (5'-FAMCAGGAGGAGGAACGTGAGCGCAG -
TAMRA-3 ') para o RpS17
ensaio domésticas foram obtidos a partir da seqüência do gene A. aegypti RpS17
- GenBank AY927787 número de adesão.
Standard curvas para qRT-PCRs foram gerados usando 15-fold serial triplicado
diluições quer da CHIKV T7 transcrição do RNA ou o RpS17 preparado
referência RNA. Equivalente CHIKV número de cópias de RNA normalizada
níveis de referência RpS17 RNA foram então calculados para o CHIKV infectados
As amostras de mosquitos, comparando números limiar de ciclo (TC) com o
respectivas normas.
Oligonucleotídeos seqüências
A tabela a seguir apresenta as seqüências de primers utilizados para DENV-2,
Plasmodium gallinaceum, CHIKV e detecções Wolbachia, bem como para o
imune análise genes relacionados.
Gene alvo Primer Seqüência (5'-3 ')
SPZ5 (AAEL001929) Fw CGGATTCTCGCCAACGAAGAA
Ap TCTGTTGGTAATGCTGCTGCTGC
REL1 (AAEL007696-RA) Fw TGGTGGTGGTGTCCTGCGTAAC
Ap CTGCCTGGCGTGACCGTATCC
IMD (AAEL010083) Fw AACAGACGCAGCAATCATTCCG
Ap GGACTTAGAAGTTGATCTGGTGCAGTG
REL2 (AAEL007624-RA) Fw GCTCAGTGCTACCGTGGGAAAC
Ap CGGGTTCGCTCTGGCATTTGTC
DOME (AAEL012471) Fw AAGATGTTCGTAACGACTCGGTCATT
Ap
GGTGAGATTGTACGTAACATGATCGGTAT
SOCS36E (AAEL000393) Fw CGACAACGTAGGAAGAATAAGCCATT
Ap AGCTGGTAATCTTCTGCAAATCCG
CECG (AAEL015515-RA) Fw TCACAAAGTTATTTCTCCTGATCG
Ap GCTTTAGCCCCAGCTACAAC
Defc (AAEL003832-RA) Fw TTGTTTGCTTCGTTGCTCTTT
Ap ATCTCCTACACCGAACCCACT
TEP20 (AAEL001794-RB) Fw TTCAGTGGCTTTCAGCAATTCTGTC
Ap GCGATCTGCACTTTGAACAAGCA
CTL (AAEL011619-RA) Fw GCAGTGTATGAATTCGTTCCAATCAACTA
Ap TCCAGGCTTCCAAGAACGTTAGGT
FREP18 (AAEL006704-RA) Fw TTCTGGTGTGTCTGGTGCTATTCAACA
Ap GCTTCCACGAACATGAGGTTCATAGC
RpS17 Fw CACTCCCAGGTCCGTGGTAT
Ap GGACACTTCCGGCACGTAGT
DENV-2 NS5 Fw ACAAGTCGAACAACCTGGTCCAT
Ap GCCGCACCATTGGTCTTCTC
PLASM SSUrRNA Fw GCTTCTTAGAGGGACATTGTGTG
Ap GCGTGCAGCCTAGTTCATC
ACTIN Fw ACCGAGCGTGGCTACTCCTT
Ap AGCGACGTAGCACAGCTTCTC
CHIKV Fw AGCTAAGCTCCGCGTCCTTTAC
Ap CCTTTCTTGCTGGCTGCATATT
RpS17b (CHIKV) Fw TCCGTGGTATCTCCATCAAGCT
Ap CACTTCCGGCACGTAGTTGTC
WSPqPCR Fw ATCTTTTATAGCTGGTGGTGGT
Ap GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT
Referências Complementares
Altschul, SF, Madden, TL, Schaffer, AA, Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., e
Lipman, D.J. (1997). Gapped BLAST e PSI-BLAST: a nova geração de proteínas
programas de pesquisa de banco de dados. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.
Braig, RH, Zhou, W., Dobson, SL, e O'Neill, SL (1998). Clonagem e
caracterização de um gene que codifica a proteína de superfície maior de bactérias
endossimbionte pipientis Wolbachia. J Bacteriol 180, 2373-2378.
Novak, MG, Ribeiro, JMC, e Hildebrand, JH (1995). 5 Hidroxitriptamina-in
as glândulas salivares de adultos fêmeas de Aedes aegypti e seu papel na regulação da
salivação. J Exp Biol 198, 167-174.
Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, MI, e 4., BW (2006). Quantitativos
análise da dengue-2 RNA do vírus durante o período de incubação extrínseco no
individual Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg 74, 132-141.
Zar, J.H. (1999). Biostatistical analysis (Upper Saddle River, Nova Jersey, Prentice
Hall).
Supplemental Data
A Wolbachia Symbiont in Aedes aegypti
Limits Infection with Dengue,
Chikungunya, and Plasmodium
Luciano A. Moreira, Inaki Iturbe-Ormaetxe, Jason A. Jeffery, Guangjin Lu, Alyssa T. Pyke,
Lauren M. Hedges, Bruno C. Rocha, Sonja Hall-Mendelin, Andrew Day, Markus Riegler, Leon
E. Hugo, Karyn N. Johnson, Brian H. Kay, Elizabeth A. McGraw, Andrew F. van den Hurk,
Peter A. Ryan, and Scott L. O'Neill
Figure S1 Wolbachia and/or dengue proteins detected in A. aegypti
mosquitoes. Western blots showing the presence of Wolbachia and/or
dengue virus in A. aegypti mosquitoes infected with DENV-2 using wsp
polyclonal antibody for Wolbachia detection and 4G4 monoclonal antibody for
DENV-2 detection. The expected infection status (Wolbachia or DENV-2) of
the mosquitoes used is indicated above each blot. (A) 14 days after thoracic
injection with DENV-2, (B) 7 and 16 days after oral feeding with DENV-2.
Figure S2 P. gallinaceum distribution and maturation in Aedes spp.
mosquitoes 7 and 14 days post infection. A) DAPI (blue) staining of an
oocyst (Oo) in the gut of a PGYP1.out (+ Wolb) mosquito, 7 days postinfection
(dpi) with Plasmodium gallinaceum. The presence of numerous
wMelPop-CLA Wolbachia (red) inside malpighian cells is detected by FISH. B)
Immunofluorescence localization of two mature oocysts (red Oo) among
immature oocysts (white Oo) in the gut epithelia of A. fluviatilis, 7dpi with P.
gallinaceum. C, D) Immunofluorescence showing the presence of mature P.
gallinaceum sporozoites (Sp, red) in the salivary gland (SG) and gut epithelia
of A. fluviatilis, 15 dpi.
Figure S3 wMelPop-CLA and wFlu Wolbachia density and distribution in
Aedes spp. mosquitoes. [A] Box plots of median numbers and 25 and 75%
percentiles of number of Wolbachia copies per mosquito, based on standard
curve analysis for the wsp gene. wMelPop-CLA infected PGYP1.out strain
(+Wolb) or PGYP1.out.tet uninfected (-Wolb) strains of A. aegypti and A.
fluviatilis mosquitoes (*** P<0.0001 by Mann-Whitney U test). [B] The first
column (A, E, I) shows the localization of wMelPop-CLA (E) and wFlu (I)
Wolbachia (green) in A. aegypti and A. fluviatilis heads. Both Wolbachia
strains are localized by immunofluorescence using a Wolbachia specific
polyclonal anti-wsp antibody and visualized using rabbit-Alexa 488 (green). B,
C, D) FISH showing the absence of Wolbachia in thoracic muscle, developing
oocytes and malpighian tubules of uninfected mosquitoes. F, G, H) wMelPop-
CLA Wolbachia is present at high densities in the thoracic muscle, embryos,
malpighian tubules (MT), fat tissue (FT) and around the midgut (MG) of
PGYP1.out mosquitoes (+Wolb), indicated by arrows. J, K, L) wFlu Wolbachia
is absent in the thoracic muscle of A. fluviatilis (J), but is present in the nurse
cells (NC), apical part of embryos (E) and in the malpighian tubules (MT),
although the densities are much lower than those observed for wMelPop-
CLA-transinfected A. aegypti (+Wolb). IFA Micrographs (A, E, I) were taken
using a filter for Alexa 488 (green, Wolbachia), Alexa 594 (contrast) and DAPI
(DNA, blue) and then merged. FISH micrographs (B-D, F-H, J-L) were taken
using a filter for Alexa 488 (contrast), Alexa 594 (red, Wolbachia) and DAPI
(DNA, blue) and then merged.
Table S1 Quantification of DENV-2 RNA after intrathoracic injection in
different mosquito lines. Data from four independent experiments.
Experiment DPIa Line
Mosquito
Partb
Mean
Copies
SEMc
n
Genomic (+) RNA
1 5 PGYP1 T+H 48.58 28.71 5
PGYP1.tet T+H 21368.13 1998.85 5
PGYP1.out T+H 40.69 9.36 5
PGYP1.out.tet T+H 9064.83 2033.46 4
PGYP1 Abd. 6.44 6.44 5
PGYP1.tet Abd. 6357.29 684.98 5
PGYP1.out Abd. 2.22 2.22 5
PGYP1.out.tet Abd. 10753.91 3840.28 4
1 14 PGYP1 Whole 25.24 4.07 2
PGYP1.tet Whole 211350.19 38687.90 8
PGYP1.out Whole 16.48 3.25 7
PGYP1.out.tet Whole 231296.71 35561.87 8
2 5 PGYP1 T+H 32.16 5.62 4
PGYP1.tet T+H 50433.40 9985.28 5
PGYP1 Abd. 10.58 2.77 4
PGYP1.tet Abd. 10511.37 2342.27 5
2 14 PGYP1 Whole 28.39 24.95 8
PGYP1.tet Whole 269158.77 79320.07 7
3 5 PGYP1 T+H 67.45 28.53 5
PGYP1.tet T+H 105011.05 8693.71 5
PGYP1.out T+H 4406.69 4207.19 5
PGYP1.out.tet T+H 91941.97 33514.55 5
PGYP1 Abd. 48.46 4.51 5
PGYP1.tet Abd. 104850.10 21403.17 5
PGYP1.out Abd. 1907.65 1851.03 5
PGYP1.out.tet Abd. 24685.36 12919.93 4
3 14 PGYP1 Whole 4934.45 1164.91 7
PGYP1.tet Whole 360293.19 44383.67 7
PGYP1.out Whole 10576.99 8870.23 7
PGYP1.out.tet Whole 374720.72 69313.16 7
4 5 PGYP1 T+H 222.85 216.20 5
PGYP1.tet T+H 58325.94 17090.05 5
PGYP1.out T+H 25.39 6.15 5
PGYP1.out.tet T+H 44368.94 8846.02 5
PGYP1 Abd. 0 0 5
PGYP1.tet Abd. 9921.17 3210.77 5
PGYP1.out Abd. 0 0 5
PGYP1.out.tet Abd. 18377.48 7324.38 5
4 14 PGYP1.out Whole 19.02 6.05 7
PGYP1.out.tet Whole 173642.11 31279.92 7
Anti-genomic (-) RNA
1 5 PGYP1 T+H 3.31 1.43 5
PGYP1.tet T+H 2894.63 415.72 5
PGYP1.out T+H 2.71 0.67 5
PGYP1.out.tet T+H 2085.81 441.10 4
PGYP1 Abd. 2.02 2.02 5
PGYP1.tet Abd. 1787.10 324.89 5
PGYP1.out Abd. 3.58 1.86 5
PGYP1.out.tet Abd. 2659.96 921.85 4
1 14 PGYP1 Whole 2.30 0.48 2
PGYP1.tet Whole 30003.31 5917.62 8
PGYP1.out Whole 1.89 0.42 7
PGYP1.out.tet Whole 22630.82 3203.45 8
2 5 PGYP1 T+H 10.10 3.26 5
PGYP1.tet T+H 1792.76 566.52 5
PGYP1.out T+H 44.60 16.31 4
PGYP1.out.tet T+H 7507.95 1947.03 5
PGYP1 Abd. 3.31 1.16 4
PGYP1.tet Abd. 2720.41 948.94 5
PGYP1.out Abd. 23.45 4.05 4
PGYP1.out.tet Abd. 7217.09 3314.48 5
2 14 PGYP1 Whole 560.26 512.60 8
PGYP1.tet Whole 31931.67 9092.21 8
3 5 PGYP1 T+H 28.47 9.64 5
PGYP1.tet T+H 9172.11 2363.80 5
PGYP1 Abd. 35.24 3.88 5
PGYP1.tet Abd. 31911.28 8267.71 5
3 14 PGYP1 Whole 2096.00 752.44 8
PGYP1.tet Whole 72146.55 9500.18 8
PGYP1.out Whole 18011.17 11279.89 8
PGYP1.out.tet Whole 55719.18 8865.57 8
4 5 PGYP1 T+H 7.97 6.06 5
PGYP1.tet T+H 4389.66 956.66 5
PGYP1.out T+H 2.31 0.52 5
PGYP1.out.Tet T+H 4977.24 983.62 5
PGYP1 Abd. 0 0 5
PGYP1.tet Abd. 3108.85 510.51 5
PGYP1.out Abd. 1.57 1.57 5
PGYP1.out.Tet Abd. 4643.40 465.31 5
4 14 PGYP1.out Whole 12.16 4.19 8
PGYP1.out.Tet Whole 29279.24 3677.83 8
a DPI=Days post-infection
b T+H= Mosquito Thorax+ Head; Abd.= Abdomen
c SEM= Standard Error of Means
Supplemental Experimental Procedures
Exposure of mosquitoes to viruses
Intrathoracic injection with DENV-2
After injection mosquitoes were transferred to 1L plastic cages within
polystyrene boxes and these boxes were maintained inside an
environmentally controlled incubator 12:12 (L:D) h, 27oC and 70% RH .
Sucrose solution and apple slices were provided on top of each cage.
Mosquitoes were collected from each cage 5 and 14 d after infection and 5
dpi (days post-infection) samples were dissected into abdomen and thorax
plus head. Samples were placed on dry ice and then transferred to -80°C until
RNA extraction.
Fourteen days after thoracic injection eight mosquitoes were collected from
each cage, briefly anesthetized with CO2 and placed on a glass plate over ice.
Wings and legs were removed with forceps and their mouthparts were
introduced into a 1cm piece of polypropylene tubing (0.61 x 0.28 mm,
Microtube Extrusions, NSW, Australia) filled with light mineral oil (Novak et al.,
1995). Females were allowed to salivate into these capillaries for 5 minutes at
room temperature, and then the capillaries were rinsed into 20 μl of fetal calf
serum with a Hamilton syringe. Samples were centrifuged at 14,000 g for 2
minutes and kept frozen (-80 °C) for further virus detection using a cell culture
enzyme immunoassay (CCEIA). Mosquito whole bodies were frozen on dry
ice and kept at -80°C for quantitative PCR virus detection.
Oral Feeding with DENV-2 and CHIKV
After infection, fully engorged mosquitoes were maintained on a 15% sucrose
solution at 12:12 (L:D) h, 27-28oC and 70% RH. To determine DENV-2
infection and dissemination rates, up to 40 mosquitoes were processed
separately at 7 and 14 d post-exposure. To follow the replication and
dissemination of CHIKV, 10-30 mosquitoes were processed on days 0, 2, 4,
7, 10 and 14 post-exposure. Mosquitoes were anesthetized using CO2, and
the legs (for DENV-2) and legs and wings (for CHIKV) from each mosquito
were removed, and these and the remaining body and head were stored
separately at -80oC. Samples were processed using the CCEIA method
(DENV-2) or qRT-PCR (CHIKV) described below. Differences in the
frequency of DENV-2 infection and dissemination between mosquito lines
were analyzed using chi-square goodness of fit tests after the 7 or 14 d
extrinsic incubation period for DENV-2 and at 14d for CHIKV (Zar, 1999).
Quantitative DENV PCR analysis
cDNA synthesis was based on the protocol described by Richardson
(Richardson et al., 2006), which allowed us to determine both the genomic (+
RNA) and replicative (anti-genomic) virus forms (- RNA). Briefly, 0.5 μg of
each RNA (2 μg for saliva samples) was mixed with 0.625 μM of either the
DENV-2 NS5 forward or reverse primer (see primers list) plus 0.2 mM dNTPs
in separate cDNA reactions. Samples were incubated at 86°C for 15 min and
5 min on ice, then 5X first strand buffer and 100U of Superscript III
(Invitrogen) was added to a total volume of 20 μl. Samples were incubated at
25°C for 10 min, followed by 42°C for 50 min and 10 min at 95°C to inactivate
the transcriptase. Negative controls (no template) were included in each
reaction.
For DENV-2 detection, cDNA samples were diluted 1:10 with milli-Q water.
The qPCR reaction consisted of 2 μl of the diluted cDNAs, 5 μl of Sybr Green
mix (Invitrogen) and 1 μM of each primer (see above), in 10 μl total volume.
Reactions were performed in duplicate in a Rotor-gene thermal cycler
(Corbett Life Sciences) with the following conditions: 50°C 2min, 95°C 2min,
45 cycles (95°C 5 s, 60°C 5 s, 72°C 10 s) followed by a melting curve (68°C
to 95°C) to check specificity. A standard curve was created by cloning the
DENV-2 NS5 fragment into pGEM®T-Easy (Promega). After linearization with
Pst I the plasmid was serially diluted into known concentrations and run in
parallel, in order to determine the absolute number of DENV-2 copies in each
sample. Mann-Whitney U tests were employed (STATISTICA V8, StatSoft,
Inc.) to examine the effect of Wolbachia infection on dengue number for each
for each paired strain combination (PGYP1 x PGYP1.tet; PGYP1.out x
PGYP1.out.tet) x body part (whole, abdomen, thorax) x age (5 or 14 d) post
inoculation. The tests were based on the means from each of 4 independently
replicated experiments.
Western blot analysis
Total protein from 5 mosquitoes of each treatment was extracted using protein
lysis buffer containing 50 mM Tris pH 7.4, 140 mM NaCl, 0.5% (v/v) Triton X-
100, 1.5μg/ml DNAse I and protease inhibitors (Roche). Samples were boiled
for 10 min in the presence of protein loading buffer, run on a 12% Laemmli
SDS gel and transferred to a nitrocellulose membrane (Immobilon-P,
Millipore) through the semidry Transblot SD (BioRad). Because the 4G4 antidengue
antibody recognizes a conformational epitope, β-mercaptoethanol
was omitted from the sample loading buffer. Membranes were blocked with
5% non-fat dried milk in TBS-T overnight at 4°C, and then probed with antiwsp
polyclonal antibody (Braig et al., 1998) (diluted 1:1,000 in 5% (w/v) skim
milk in TBS-T) or anti-dengue (4G4) monoclonal antibody (1:100 dilution) for
1h at room temperature. After 3 washes in TBS-T, membranes were
incubated with anti-rabbit or anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugated
antibody (Sigma) (1:4,000) for 1h, respectively. Following washing in TBS-T
blots were developed with NBT/BCIP (Promega). Western blots on
Wolbachia-infected mosquitoes revealed a single band around 26 kDa that
corresponds with the correct molecular weight of wsp (25,540Da) (Braig et al.,
1998), whereas the 4G4 antibody revealed a band of around 50 kDa in
dengue-positive mosquitoes.
Wolbachia density in Aedes spp. mosquitoes
A standard curve was created by cloning a Wolbachia wsp gene fragment
(Braig et al., 1998) into pGEM®T-Easy (Promega). After linearization with Pst I
the plasmid was serially diluted into known concentrations and run in parallel,
in order to determine the absolute number of Wolbachia copies contained in
each mosquito sample. Mann-Whitney U tests were employed (STATISTICA
V8, StatSoft, Inc.) to examine the density of Wolbachia in both mosquito
species.
PCR amplification of Wolbachia sequences from A. fluviatilis
The Wolbachia surface protein gene wsp was amplified using the primers 81F
and 691R that amplify a wide range of Wolbachia strains (Braig et al., 1998).
PCR cycling conditions were as follows: 94°C 3 min, (94°C 30 s, 52°C 30 s,
68°C 90 s) x 35 cycles, then 68°C 10 min. The reaction mixture contained 625
nM of each primer, 125 μM dNTPs, 1.5 mM MgSO4, 20 ng of mosquito DNA
and 0.5 μL of proof-reading Elongase enzyme mix (Invitrogen) in a final
volume of 25 μl. PCR products were separated in 1% agarose gels and
stained with ethidium bromide.
Six independent PCR amplicons were cloned into the pGEM®T Easy vector
(Promega) and six clones were sequenced with T7 and M13R universal
primers using the AB Big Dye terminator Version 3.1 kit with fluorescent
sequencing (FS), AmpliTaq DNA polymerase (Perkin-Elmer) and analysed on
(AB) 3730xl -96 capillary sequencer. Sequencing was done at the Australian
Genome Research Facility (AGRF). Sequence similarity searches were
performed using the BLAST algorithm (Altschul et al., 1997) at NCBI, and a
phylogenetic tree was constructed using DNAstar (Lasergene). A partial wsp
gene sequence from wFlu has been deposited in GenBank (Accession
number GQ917108).
Relative quantification of CHIKV RNA copy numbers
RNA standards were produced for the relative quantification of CHIKV RNA
copy numbers normalized to RNA levels of the ribosomal A. aegypti
housekeeping gene RpS17. Firstly, a CHIKV RNA synthetic transcript was
produced by RT-PCR amplification of a 588 bp fragment from the CHIKV
strain 06113879 using primers designed from its deduced partial E1 structural
gene sequence (GenBank accession number EU404186). The one-step RTPCR
was performed using the Superscript® III One-Step RT-PCR System with
Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen Life Technologies, California)
according to the manufacturer’s instructions with 400 nM of each primer and 5
μl of CHIKV RNA in a final reaction volume of 50 μl. Amplification was
performed in an Eppendorf Mastercycler gradient (Eppendorf, Germany) and
included one cycle at 50oC for 15 min for reverse transcription, an inactivation
step at 94oC for 2 min, 40 cycles of 94oC for 2 min, 59oC for 30 sec and 68oC
for 2.5 min and final extension at 68oC for 5 min. Amplicon DNA was purified
using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Australia) and supplied
instructions and then cloned into the plasmid vector pGEM®-T Easy
(Promega). After the presence and orientation of the insert DNA was verified
by nucleotide sequencing, the plasmid was linearized for in vitro RNA
transcription by digestion with Spe I. Synthetic RNA transcripts were then
prepared using the Riboprobe® T7 System (Promega) before multiple
treatments with DNase I (RQ1 RNase-Free DNase; Promega Corporation, WI,
USA). The final CHIKV transcript of 654 bp was stored in single use aliquots
at -80oC and RNA levels were determined by spectrophotometry immediately
prior to use. For the housekeeping gene RpS17 RNA standard, total RNA
from whole A. aegypti mosquitoes was extracted as before with the exception
that on-column DNase treatment was omitted. In this instance, RNA was
DNase treated and stored as described for the CHIKV RNA transcript.
To enable a direct comparison of CHIKV RNA copy numbers in prepared
mosquito body plus head, and legs plus wings samples, two specific one-step
qRT-PCR real-time TaqMan® assays were developed targeting the CHIKV E1
and A. aegypti RpS17 genes respectively. Both were performed using the ABI
7500 Fast Real-Time PCR System (PE Applied Biosystems, Foster City,
Calfornia) and all reaction mixes, amplification parameters, result analysis and
CHIKV primer and probe sequences were used as previously reported.
Primers and dual labelled probe (5’-FAMCAGGAGGAGGAACGTGAGCGCAG-
TAMRA-3’) for the RpS17
housekeeping assay were derived from the A. aegypti RpS17 gene sequence
– GenBank accession number AY927787.
Standard curves for qRT-PCRs were generated using triplicate 15-fold serial
dilutions of either the CHIKV T7 RNA transcript or the prepared RpS17
reference RNA. Equivalent CHIKV RNA copy numbers normalized to
reference RpS17 RNA levels were then calculated for the CHIKV infected
mosquito samples by comparing threshold cycle numbers (Ct) with the
respective standards.
Oligonucleotides sequences
The following table presents the primers sequences used for DENV-2,
Plasmodium gallinaceum, CHIKV and Wolbachia detections as well as for the
immune related genes analysis.
Target Gene Primer Sequence (5’- 3’)
SPZ5 (AAEL001929) Fw CGGATTCTCGCCAACGAAGAA
Rv TCTGTTGGTAATGCTGCTGCTGC
REL1 (AAEL007696-RA) Fw TGGTGGTGGTGTCCTGCGTAAC
Rv CTGCCTGGCGTGACCGTATCC
IMD (AAEL010083) Fw AACAGACGCAGCAATCATTCCG
Rv GGACTTAGAAGTTGATCTGGTGCAGTG
REL2 (AAEL007624-RA) Fw GCTCAGTGCTACCGTGGGAAAC
Rv CGGGTTCGCTCTGGCATTTGTC
DOME (AAEL012471) Fw AAGATGTTCGTAACGACTCGGTCATT
Rv
GGTGAGATTGTACGTAACATGATCGGTAT
SOCS36E (AAEL000393) Fw CGACAACGTAGGAAGAATAAGCCATT
Rv AGCTGGTAATCTTCTGCAAATCCG
CECG (AAEL015515-RA) Fw TCACAAAGTTATTTCTCCTGATCG
Rv GCTTTAGCCCCAGCTACAAC
DEFC (AAEL003832-RA) Fw TTGTTTGCTTCGTTGCTCTTT
Rv ATCTCCTACACCGAACCCACT
TEP20 (AAEL001794-RB) Fw TTCAGTGGCTTTCAGCAATTCTGTC
Rv GCGATCTGCACTTTGAACAAGCA
CTL (AAEL011619-RA) Fw GCAGTGTATGAATTCGTTCCAATCAACTA
Rv TCCAGGCTTCCAAGAACGTTAGGT
FREP18 (AAEL006704-RA) Fw TTCTGGTGTGTCTGGTGCTATTCAACA
Rv GCTTCCACGAACATGAGGTTCATAGC
RpS17 Fw CACTCCCAGGTCCGTGGTAT
Rv GGACACTTCCGGCACGTAGT
DENV-2 NS5 Fw ACAAGTCGAACAACCTGGTCCAT
Rv GCCGCACCATTGGTCTTCTC
PLASM ssurRNA Fw GCTTCTTAGAGGGACATTGTGTG
Rv GCGTGCAGCCTAGTTCATC
ACTIN Fw ACCGAGCGTGGCTACTCCTT
Rv AGCGACGTAGCACAGCTTCTC
CHIKV Fw AGCTAAGCTCCGCGTCCTTTAC
Rv CCTTTCTTGCTGGCTGCATATT
RpS17b (CHIKV) Fw TCCGTGGTATCTCCATCAAGCT
Rv CACTTCCGGCACGTAGTTGTC
WSPqPCR Fw ATCTTTTATAGCTGGTGGTGGT
Rv GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT
Supplemental References
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and
Lipman, D.J. (1997). Gapped BLAST and PSI‐BLAST: a new generation of protein
database search programs. Nucleic Acids Res 25, 3389‐3402.
Braig, H.R., Zhou, W., Dobson, S.L., and O'Neill, S.L. (1998). Cloning and
characterization of a gene encoding the major surface protein of the bacterial
endosymbiont Wolbachia pipientis. J Bacteriol 180, 2373‐2378.
Novak, M.G., Ribeiro, J.M.C., and Hildebrand, J.H. (1995). 5‐Hydroxytryptamine in
the salivary glands of adult female Aedes aegypti and its role in regulation of
salivation. J Exp Biol 198, 167‐174.
Richardson, J., Molina‐Cruz, A., Salazar, M.I., and 4th., B.W. (2006). Quantitative
analysis of dengue‐2 virus RNA during the extrinsic incubation period in
individual Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg 74, 132‐141.
Zar, J.H. (1999). Biostatistical analysis (Upper Saddle River, New Jersey, Prentice
Hall).
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